粘细菌来源的新型β-1,6-葡聚糖水解酶结构域功能的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1课题意义glum是一种筒状结构蛋白，具有β-1,6-葡聚糖水解酶功能，参与粘细菌子实体的形成和粘细菌的捕食行为，glum蛋白的缺失会导致粘细菌无法形成成熟的子实体结构。

因此本研究将通过其作为oar蛋白同源蛋白的性质，通过将glum不同片段回补进oar敲除菌株中，通过对包括子实体形成、多糖产生和捕食运动等发育表型的观察确定glum不同片段的功能，进而表征其不同片段的功能域特征。

本研究将为解析新型抗真菌蛋白的结构域功能提供基础证据，也为后期解析其参与粘细菌发育学行为的作用机制提供依据。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标通过将glum不同片段回补oar敲除菌株中，通过对回补菌株子实体形成，多糖产生和捕食运动等发育表型的观察确定glum不同片段的功能，进而表征其不同片段的功能域特征。

2.2研究内容（1）将glum基因从头开始截取150、250、350、500个氨基酸基因编码片段，并与同源蛋白oar的同源臂片段连接（2）使用t4载体和大肠杆菌扩增基因。

（3）将扩增的片段连上表达载体pbj113，在大肠杆菌里复制。

3. 研究的方法与方案

3.1实验方案（1）使用重叠延伸法将同源臂片段与不同的glum基因片段连接。

（2）使用双酶切法切开t质粒并使之与不同长度基因片段相连。

（3）将连接的质粒导入大肠杆菌，涂布在含有氨苄青霉素的抗性平板上，长出后挑菌落验证，含有所需质粒的菌大摇、保菌并大提质粒。

4. 研究创新点

粘细菌作为较新的研究热点，其各项生理功能以及发育机制都有待于研究，GluM作为膜蛋白，只能在粘细菌中表达，其各结构域对于粘细菌发育过程的影响还鲜有报道。

5. 研究计划与进展

5.1研究计划：2017.11:使用重叠延伸的方式将不同长度的glum基因片段与同源臂片段相连，验证、回收。

使用双酶切酶连将各延伸片段与t4载体相连。

2017.12:将酶连产物导入大肠杆菌，使用氨苄青霉素抗性的lb培养基37℃培养过夜。