酵母smf1突变体的构建及其离子稳态调控能力初步分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

在植物生长和发育过程中，金属元素起到了重要的作用，它们参与各类生命活动，例如钙元素参与构成细胞壁、铁元素参与叶绿素的形成、锰元素参与光合作用等等[1]。

但各类金属离子在植物体内的浓度均需维持在一定范围内，若某些金属离子过剩或缺乏, 都将不同程度地影响到植物的生长及发育，因而说明维持金属离子稳态的重要性。

研究表明，起到转运金属离子、维持其稳态重要作用有多个蛋白质家族，其中nramp （natural resistance-associated macrophage protein）是最重要蛋白家族。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标及内容: 通过醋酸锂转化酵母法来敲除酿酒酵母中Smf基因，制备相应的突变体，并将突变体和野生型的离子稳态进行比对，以研究该基因对金属离子稳态的调控能力。

研究中拟解决的关键问题: 1. 构建并制备基因敲除组件；2. 敲除酿酒酵母中的Smf基因；3. 设计实验将制备的smf突变体与野生型进行功能对照，从而探究其对金属离子的转运调控能力。

3. 研究的方法与方案

研究方法及实验设计:1 基因敲除组件的构建首先设计带有smf基因上游40个碱基及kanmx基因上游19个碱基及smf基因下游40个碱基及kanmx下游19个碱基的组合引物，使用该引物以pug6模板进行pcr，将kanmx基因从pug6中扩增出来，将得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用dna胶回收试剂盒进行回收，即得到基因敲除组件。

基因敲除步骤原理是通过加入特定试剂后，在特定条件下，kanmx基因替代所要敲除的基因而达到目的。

2 酿酒酵母的培养将保存的酿酒酵母菌活化后，以平板划线法接种于固体培养基上，待长出单菌落后即可将单菌落接种于ypd液体培养基中，培养至od600至0.5左右（应小于0.5），此时酿酒酵母活力最为适宜，即可进行基因敲除步骤。

4. 研究创新点

通过对酿酒酵母中Smf基因进行相关突变体的制备，并对其进行金属离子稳态调控能力的研究，从而进一步理解其同源基因Nramp基因的功能及作用机理。

5. 研究计划与进展

2017年12月 完成文献综述写作2018年1月至2月 完成文献查找、筛选及前期实验方案设计2018年3月 完成开题报告及酿酒酵母Smf基因的敲除工作2018年4月 完成酿酒酵母smf突变体与野生型的点斑实验、ICP测定金属离子含量实验，并完成中期报告2018年5月 完成酿酒酵母smf突变体与野生型的荧光指示剂染色实验，进行整体课题实验补充及查漏补缺，并完成结题答辩