水稻CRISPR基因编辑载体的高通量转化及鉴定方法的探索开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 研究意义水稻是我国乃至全球最为重要的粮食作物之一，全世界50%以上的人口以水稻为主食。

我国是世界上最大的水稻生产国和消费国，水稻对我国粮食生产和安全起着重要的作用。

水稻不育是水稻产量的大问题，因而解决水稻不育问题迫在眉睫。

2. 研究的基本内容和问题

4 研究目标利用crispr基因编辑技术和日本晴遗传转化体系，对水稻愈伤进行高通量的遗传转化，筛选不育突变体，最终找到一种经济简便易行的鉴定方法。

5 研究内容15种携带不同crispr/cas9载体的菌种混合培养，侵染水稻愈伤组织，培养后取叶片进行序列鉴定，进行不育突变体材料的筛选。

6 拟解决的关键问题由于是15种携带不同sgrna的crispr/cas载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，因而导致鉴定基因突变类型时要考虑多方面的可能性。

3. 研究的方法与方案

7 研究方法在http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr/crispr网页进行sgrna的序列设计，合成引物，酶切酶连后构建crispr/cas载体，转化大肠杆菌进行阳性克隆，测序验证序列，如是所需序列，提取大肠杆菌质粒，再次转化农杆菌。

同时诱导水稻愈伤。

然后15种携带不同crispr/cas 9载体的菌种混合培养，侵染水稻愈伤组织，培育后取叶片进行序列鉴定，首先要进行的是鉴定细胞中是否存在转基因，设计crispr/cas载体片段引物，扩增转入的载体片段测序，从而鉴定转入哪种载体。

4. 研究创新点

11 特色或创新之处侵染水稻愈伤组织的是15种携带不同特异导向不育基因片段的sgrna的混合农杆菌，不再是携带特异导向不育基因片段的sgrna的单一菌种，这使得实验结果存在多种可能性。

植株不育性状可能是单一crispr/cas载体转入造成的，也可能是多种crispr/cas载体转入造成的。

基因组测序后还可研究植株基因表达的偏好性，即植物不育通常是由哪些基因发生突变引起的,发生什么类型的基因突变。

5. 研究计划与进展

12 研究计划及预期进展2017年8月-2017年9月水稻愈伤的培养及其侵染2017年9月-2017年10月 侵染后水稻愈伤的筛选及其出苗2017年10月-2017年12月水稻移栽至实验田间培养2018年1月-2018年5月水稻基因组的测序，鉴定突变类型