堆肥菌株A.fumigatus Z5多糖单加氧酶促进木质纤维素分解机制研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

中国是一个农业生产大国，每年产生大量的纤维素类农业废弃物。

研究数据表明：2014年中国主要大田作物秸秆资源总量为8．97亿t，可收集资源量为7．69亿t，可能源化利用秸秆资源总量为1．86亿t[1]。

如不快速科学的处理和利用，不仅造成资源浪费，而且将导致严重的环境污染[2]，特别是富含木质纤维素类物质的禽畜粪便、作物秸秆等，如何合理处理这些农业废弃物迫在眉睫[3] [4]。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题1．研究目标 1）通过异源表达得到较纯的pmos，借助二维核磁共振等技术手段验证蛋白同源建模所得蛋白结构的准确性； 2）明确 pmos 催化纤维素分解及与木质纤维素酶协同作用提高催化效率的机制。

2.研究内容1）菌株z5 中pmos 基因克隆与表达及其酶学特性研究根据模块分析和荧光定量结果并利用菌株 z5 的基因组数据，克隆具有完整pmos 功能模块的基因；利用酵母表达载体 ppiczαa 异源表达菌株 z5 中的 pmos基因；利用镍柱纯化 pmos 并进行 lc-ms/ms 鉴定；研究纯化的 pmos 的基本酶学特性，为进一步研究其催化机制提供基础。

2）通过同源建模预测pmo-5的蛋白晶体结构以及与底物结合的活性位点先通过 swissmodel 在线服务器由蛋白的基础序列得到初步三维结构模型，在此基础上做verify-3d检测、procheck检测、eerat评估，对得到三维模型进行评估。

3. 研究的方法与方案

1.研究方案及方法1) pmos 基因的克隆与表达根据 pmos 基因序列特点和表达载体 ppiczαa 多克隆位点的特点,设计含有合适限制性内切酶位点的引物,以合成的 cdna 为模板,扩增 pmos 基因的完整 orf;将 pmos 基因片段和表达载体 ppiczαa 分别双酶切后,将酶切产物回收并用 t4 连接酶进行酶连,获得表达载体 pmos-ppiczαa。

将构建好的表达载体 pmos-ppiczαa 线性化后电击转化到酵母 x33 感受态中;将菌体悬液涂布于含有 zeocintm(100 μgml-1)的 ypds 平板上,30℃培养,直至单个菌落出现,利用菌落 pcr 的方法验证转化子;转化子在甲醇诱导条件下进行表达,并利用 sds-page 检测 pmos 的表达情况。

2) pmos 的纯化与鉴定通过镍柱纯化 pmos 蛋白,并利用双向电泳分析其纯度;将得到的蛋白点从胶内取出,经胰蛋白酶处理后进行质谱分析,将分析结果录入蛋白质数据库 mascot(http://www.matrixscience.com/)进行比对分析,最终鉴定该蛋白。

4. 研究创新点

特色或创新之处1)本项目的特色目前,国内外关于 pmos 的研究比较少,还鲜有针对其参与木质纤维素分解及提高木质纤维素酶催化效率的机制研究。

本研究项目将采用电子顺磁波共振、等温滴定量、表面等离子体共振等技术研究 pmos 在纤维素底物识和绑定过程,为揭示其分解木质纤维的机制提供坚实的理论基础。

2)本项目的创新研究材料创新:本项目研究的菌株 z5, 不仅能够分泌丰富的木质纤维素酶系,更为重要的是它能在 60℃下正常生长与产酶,其分泌的木质纤维素酶系最适催化温度为 50℃,非常适合用于堆肥化处理各种农业废弃物,提高堆肥生产效率。

5. 研究计划与进展

2018.2-2018.3 将目的基地导入表达载体，得到pmo-5的粗蛋白，并得到酶动力学的相关数据；同时得到pmo-5的预测结构。

2018.3-2018.4 纯化浓缩pmo-5蛋白，为后续研究做准备；计算生物学部分准备好底物和蛋白分子，待对接。

2018.4-2018.5 完成pmo-5的电子顺磁波谱共振技术(epr)、x-ray衍射实验，对蛋白晶体有初步认知；完成蛋白对接实验，得到相关活性位点信息。