菊花CmREV基因的克隆及表达特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义菊花（chrysanthemum grandiflorum）是菊科菊属的多年生草本植物，在我国有着悠久的栽培历史，是中国十大传统名花、花中四君子和世界四大切花之一，具有极高的观赏、食用和药用价值，深受人们的喜爱。

迄今为止，国内外菊花育种者利用极其丰富的种质资源，通过常规杂交育种手段在株型、叶型、花型、花色等观赏性状改良方面取得了卓有成效的业绩。

microrna(mirna)是一类长度很短的非编码调控单链小分子rna，其中mir165/166基因和它们的靶标基因hd-zip iii的多样性可以介导植物生长和发育的多个方面。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标获得REV基因，并初步研究该基因在菊花中的表达特性。

2.研究内容（1）克隆菊花REV基因；（2）该基因在菊花不同组织器官的定量分析；（3）5' RLM-RACE验证miR165/166的靶基因剪切位点；（4）亚细胞定位分析； （5）转录激活活性分析；3.拟解决的关键问题（1）完成REV基因的克隆及同源转化（菊花）和异源转化（拟南芥）；（2）组织定量分析；（3）初步探究REV基因的功能及机理。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法（1）rna提取及反转录 取组织(0.15g)液氮研磨成粉,加入1ml trizol完全覆盖,匀浆转移至2ml离心管,室温静置5min后12000rpm 4℃离心15min；上清液加入200μl氯仿震荡混匀,静置10min后,12000rpm离心15min，视情况多次抽提；吸取上清于新离心管,加入等体积异丙醇颠倒混匀,静置10min后12000rpm离心10min，弃去上清加入75%乙醇漂洗rna后12000rpm离心5min，弃去乙醇待其完全挥发后加入25μl depc水溶解。

稀释10倍用于rna完整性检测和浓度测定,达到能够用于反转录标准后-70℃保存。

rna反转录得到的cdna作为扩一增基因全长的模板,具体反转录过程参照试剂盒说明书,普通pcr检测反转录获得的cdna质量。

4. 研究创新点

REV基因在拟南芥中研究最多，而其在菊花中的作用尚未见报道，对菊花表达特性的研究也未见报道，因此本实验探究REV对菊花的影响。

5. 研究计划与进展

第一阶段：2017.04-2017.06(1) 进行实验前期工作，查阅相关文献资料，熟悉实验流程、实验内容、实验步骤等；(2) 栽培菊花品种神马。

第二阶段：2017.06-2017.09(1) 克隆菊花rev基因；(2) 该基因在菊花不同组织器官的定量分析；(3) 5' rlm-race验证mir165/166的靶基因剪切位点。

第三阶段：2017.09-2018.02(1) 亚细胞定位分析； (2) 转录激活活性分析；(3) 初步探究rev基因在菊花生长发育过程中的作用。