高温堆肥菌株烟曲霉Z5胞外木聚糖酶基因xyn10c的毕赤酵母异源表达及其酶学性质研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：木质纤维素是地球上资源量最大的可再生资源和最主要的生物质资源，全世界农作物每年会产生大约2000亿吨的农业废弃物，是自然界最广泛的木质纤维素来源之一，包括农作物秸秆、稻壳、甘蔗渣、玉米芯等。

因木质纤维素中含有将近75的多聚糖，因此这些农业废弃物被认为是在生物能源等应用领域中能够取代粮食作物的最合适原材料［1］。

木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素以及木质素，由于其自身结构的复杂性，木质纤维素具有很大的抗降解特性，比如纤维素的结晶度和聚合度，以及包含的木质素、半纤维素和乙酰化组分，这些都成为了实现木质纤维素高效生物转化需要解决的问题。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：以提高木聚糖酶的生产效率和使用效果为目标，利用基因重组技术实现各种木聚糖酶基因的异源表达，构建一套成熟的、能够与规模化生产相适应的木聚糖酶异源表达系统，对于木聚糖酶的应用具有很大的意义。

研究的内容：本实验室从髙温堆肥样品中分离到了一株髙效的纤维素分解真菌，鉴定为烟曲霉并命名为a. fumigatus z5，其基因组测序也已经完成。

我们以燕麦木聚糖作为唯一碳源发酵培养a. fumigatus z5，诱导胞外降解木聚糖的木聚糖酶基因的表达，通过rt-pcr结果，分析z5中每个木聚糖酶基因的表达水平，并结合其表达水平的变化速率，最终得到了几个主要的木聚糖降解相关基因，包括：４个内切木聚糖酶基因、２个木聚糖苷酶基因、１个乙酰木聚糖酯酶基因和１个阿拉伯呋喃糖苷酶基因。

3. 研究的方法与方案

研究方法：方法：1、微生物培养大肠杆菌培养基（lb）、毕赤酵母培养基（ypd、mmh、mdh、bmgy、bmmy）组成成分参见invitrogen公司的毕赤酵母表达系统操作手册，重组质粒的筛选时lb培养基需加入25μg/ml zeocin，在筛选重组毕赤酵母菌株时ypd培养基需加入100μg/mlzeocin。

在37℃，200r/min的旋转式摇床上进行大肠杆菌的培养。

在30℃，250r/min的条件下进行毕赤酵母的培养。

4. 研究创新点

特色或创新之处目前，国内市场上成熟的纯度较高的木聚糖产品相对较少，其中的一个主要的限制因素是缺乏能够进行规模化生产的高产菌株。

此外，半纤维素酶产生菌一般都能产生纤维素酶，即同时分泌两类酶的混合物，这样应用传统的微生物学和生物化学方法研究半纤维素酶就遇到了诸多困难。

而分子生物学技术的进步则为深入研宄及解决这些问题提供了新的途径，随着木聚糖酶市场需求和应用范围的不断扩大，利用基因重组技术实现各种木聚糖酶基因的异源表达，构建一套成熟的、能够与规模化生产相适应的木聚糖酶异源表达系统，对于木聚糖酶的应用具有很大的意义。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展2018月2月至3月：查阅文献，制定研究计划，实验步骤；2018月3月至4月：微生物培养，分离目标基因，进行表达载体的构建和毕赤酵母的电转化；2018年4月至5月：重组基因在毕赤酵母中的诱导表达、进行菌体含量、酶活及蛋白质含量测定。