利用病毒诱导基因沉默技术（VIGS）快速鉴定菊花脑基因功能的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

基因功能的鉴定通常借助恒定的基因遗传转化等反向遗传学技术进行鉴定，其首要的条件需有成熟的植株再生体系，而对于一些缺乏高效遗传转化体系的物种，其基因功能则较为困难。

而病毒介导的基因沉默技术（virus induced gene silencing, vigs）则可以克服上述不足，为上述物种的基因功能鉴定提供了有力的手段。

1.vigs 技术基因沉默原理转录后基因沉默(pgs)是植物体内最适合和最特异的一种降解外源 dna 或 rna 的方式，从而保护自身的一种防卫机制。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标（1）构建菊花脑vigs技术体系；（2）明确菊花脑sgr1基因功能。

2.研究内容（1）构建sgr1基因的trv表达载体；（2）通过注射法以及真空渗透法进行植株侵染；（3）观察侵染植株的表型，拍照记录；（4）检测沉默后基因的表达水平。

3.拟解决的关键问题（1）菊花脑不同发育阶段对沉默效率的影响；（2）不同侵染方法对沉默效率的影响。

3. 研究的方法与方案

1. 拟采取的研究方法（1）trv载体的构建：采用rt-pcr技术扩增目标基因片段，采用酶切连接的方法构建沉默载体trv2-sgr1；（2）侵染植株的准备：采用直播法将菊花脑种子播种在穴盘中，选取不同发育阶段的幼苗进行侵染处理；（3）植株的侵染：采用和真空渗透法进行侵染；以空载作为对照。

比较不同的侵染时间的沉默效果；2.技术路线菊花脑叶片中提取rna；反转录成cdna；克隆sgr1基因保守片段；trv2-sgr1病毒载体；选取20d幼龄的菊花脑幼苗真空渗透侵染；表型观察；sgr1基因表达量测定；建成菊花脑vigs技术体系并明确sgr1基因功能。

3.可行性分析本课题的理论价值主要在于对菊花vigs技术体系的构建与优化,证明trv病毒载体能够有效地诱导菊花sgr1基因沉默,本试验搭建起的技术平台,后期可以很好地用于菊花新型花色花香乃至更多花器官相关基因功能的批量验证。

4. 研究创新点

本申请项目率先开展菊花脑病毒诱导基因沉默体系的建立，旨在探讨烟草病毒的非寄主植物是否对TRV敏感，为TRV病毒的拓展应用提供证据，同类研究国内外未见报道。

5. 研究计划与进展

2017.4-2017.7 构建TRV2-SGR1载体；2017.7-2017.12 对菊花脑幼苗进行侵染转化，观察表型；2017.12-2018.02 SGR1基因表达水平的RT-PCR检测；2018.02-2018.04 撰写研究报告，完成项目研究内容。