乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. RF-1的酯酶基因表达与功能研究开题报告

全文总字数：7919字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、研究意义及现状

研究表明，杂草对于农作物的生长发育有较大的不利影响^[1]。除草剂 (herbicide)，是指在不对农作物生长产生大量不利影响的前提下，将农作物生长区域中的杂草选择性杀灭的一类农药^[2]。因为大部分除草剂具有性质稳定、效果良好、适应性广、持续效果较久等特征，于是近几年来除草剂作为保障农作物正常生长的一种重要农药，在世界范围内的使用频率很高，且用量更是呈现出逐年上升的趋势。二苯醚类除草剂是目前世界上使用量最大的除草剂之一，此类除草剂具有高效、低毒、高选择性等优良特点，目前已在世界各地得到广泛应用^[3]。

乳氟禾草灵（图1）是一类典型的二苯醚类除草剂。是由美国ppg工业公司在1965年开发，是一种选择性芽前和芽后除草剂，用于禾谷类作物、玉米、棉花、花生、番茄、水稻、大豆田防除阔叶杂草,具有活性高、杀草谱广、毒性低的特点。在不利于大豆生长发育的环境条件下,如高温、低洼地排水不良、低温、高湿、病虫危害等,易造成药害,症状叶片皱缩,有灼伤斑点^[4]。

2. 研究的基本内容和问题

1.1 研究目标

研究乳氟禾草灵降解菌株bacillus sp. rf-1的酯酶基因的功能

1.2 研究内容

3. 研究的方法与方案

2.1 研究方法

（1）对已导入乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. RF-1酯酶基因的大肠杆菌进行接菌、扩增并诱导酯酶基因表达；

（2）通过超声波破碎、离心等步骤提取酯酶得到粗酶液；

（3）通过凝胶层析、透析等步骤处理粗酶液得到纯酶液；

（4）通过对纯酶液进行电泳并进行条带分析验证所制得的纯酶液是否为目标酶；

（5）使用制得的纯酶液与乳氟禾草灵进行酶反应，通过控制不同的反应时间来对反应产物进行捕捉，通过萃取、过滤等方法纯化反应产物；

（6）通过气相色谱法、高效液相色谱法、超高效液相-质谱联合等方法对反应产物进行分析，确定反应产物的成分；

（7）通过高效液相色谱法测定酶对不同底物的米氏常数。

2.2 技术路线

2.3 实验方案

2.3.1 接菌及扩大培养：

向2个装有LB液体培养基的锥形瓶中分别接入已导入乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. RF-1不同酯酶基因的2种大肠杆菌液2 mL及50μL 抗生素，置于37℃摇床中培养约1.5 h ，至体系OD值达到0.6-0.8之间；

2.3.2 诱导及扩大培养：

向两个锥形瓶中分别将入60μL 0.3mmoL/L IPTG溶液，置于16℃摇床中过夜培养；

2.3.3 细胞破碎

（1）2个锥形瓶各转移至2个50 mL离心管中，配平；

（2）8000 rpm，离心5 min，去上清；

（3）向每个离心管中分别加入5 mL，20 mmol Tris-HCl，将沉淀打散混匀，相同种菌液汇于一个离心管中，配平；

（4）8000 rpm，离心 4min，去上清；

（5）向每个离心管中分别加入15 mL，20 mmol Tris-HCl，将沉淀打散混匀；

（6）将离心管置于冰水浴中后将超声波破碎仪探头深入管内进行超声波破碎：破碎2 s，停止1 s，共进行15 min；

（7）4℃，11000 rpm，离心15 min，保留上清于冰水浴中。

2.3.4 纯化（过柱）

（1）向2个凝胶层析柱中分别加入10 mL缓冲液（Binding Buffer pH 7.4）用以平衡柱床，待缓冲液过完后分别上样（留下部分以便电泳），收集第一次上样后流出的穿透液；

（2）按照表1上样量和收集量进行50 mmol咪唑-Tris-HCl洗脱液上样及收集：

表1 洗脱液上样量、收集量表

Table1 Fm of sample sizecollection scale f eluent

收集液分别命名为：HO 100（100 mmol洗脱液洗脱时收集的5 mL HO酶液），

HO 150（150 mmol洗脱液洗脱时收集的2 mL HO酶液），AP 150（150 mmol洗脱液洗脱时收集的5 mL AP酶液），AP 200 （200 mmol洗脱液洗脱时收集的2 mL AP酶液）；

（3）全部上样步骤结束后，向每个层析柱中加入10 mL缓冲液（Binding Buffer pH 7.4）冲洗柱床，并在柱床中保留一些缓冲液，关闭封存柱床；

2.3.5 电泳

（1）准备7个1.5 mL离心管，每个离心管中分别加入：

40μL AP粗酶液，40μL AP 150，40μL AP 200

40μL HO粗酶液，40μL HO 150，40μL HO 150，10μL marker

再向每个离心管中加入10μL 4×Buffer，混匀，沸水浴12 min，向预制胶中上样（marker上样10μL，样品上样50μL）；

（2）稳压140V，电泳约1 h；

（3）用迅蓝染液染色，对照marker观察电泳结果；

2.3.6 透析

（1）取4个透析袋，用去离子水冲洗后向透析袋中分别灌入AP 150，AP 200，HO 100，HO 150，夹好后放入Tris-HCl溶液中浸泡过夜，次日将相同酶液混合；

2.3.7 酶反应（乙羧氟草醚记为YS，乳氟禾草灵记为RF）

（1）取26个10 mL离心管，分别标记并装配：

15μL YS，3 mL，20 mmol Tris-HCl缓冲液

对照

15μL RF，3 mL，20 mmol Tris-HCl缓冲液

HO 120μL（5 min，10 min，20 min，

30 min，40 min，60 min），880μL

15μL YS，2 mL Tris-HCl缓冲液 Tris-HCl缓冲液

AP 120μL（5 min，10 min，20 min，

30 min，40 min，60 min），880μL

处理 Tris-HCl缓冲液

HO 70μL（5 min，10 min，20 min，

30 min，40 min，60 min），930μL

15μL RF，2 mL Tris-HCl缓冲液 Tris-HCl缓冲液

AP 120μL（5 min，10 min，20 min，

30 min，40 min，60 min），930μL

Tris-HCl缓冲液

置于37℃水浴中进行酶反应，到反应时间时取出，加入20μL HCl后加入3 mL CH₂Cl₂，3管一组振荡2 min；

（2）振荡后用移液枪吸去上层废液，后每管视情况加入适量无水Na₂SO₄；

（3）取2 mL至2 mL离心管中备用。

2.3.7 检验（方法复杂此处简略叙述）

（1）气相色谱法

检测器：氢火焰离子化检测器（FID）

载气：N₂（20 mL min^-1）

H₂（30 mL min^-1），空气（250 mL min^-1）

喷射器：210℃，检测器：250℃，汽化室：280℃

（2）高效液相色谱法

流动相：70-80 甲醇（色谱纯）

波长：230 nm/280 nm

柱温：30℃

检测时间：10 min—15 min

（3）超高效液相-质谱联合方法

2.3.8 米氏常数（Km）测定

（1）重复以上2.3.1—2.3.7中步骤；

（2）通过酶标仪测定纯酶液浓度；

（3）分别在离心管中加入等量不同浓度的底物（30 ppm—150 ppm）及等量纯酶液，补足20 mmol Tris-HCl缓冲液配置为3 mL体系，再配置体系为3 mL分别含底物10 ppm，20 ppm，30 ppm，40 ppm，50 ppm的对照以便制作标准曲线；

（4）通过高效液相色谱对以上反应体系进行检测，得到不同浓度底物所对应的液相图谱，记录对照组每个浓度所对应的底物峰面积，得到底物标准曲线，记录进行酶反应组不同底物浓度所对应的底物峰，代入标准曲线，计算得到反应平均速率。通过双倒数作图法计算求得每种酶对不同底物的米氏常数（Km）。

2.4 可行性分析

（1）实验室具备已导入乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. RF-1酯酶基因的大肠杆菌菌种，并进行了妥善的菌种保藏措施；

（2）实验室具备一套完善的超声波破碎仪、高速离心机等设备可以进行细胞破碎工作并提取粗酶液；

（3）实验室已经具备每种酶对所测不同底物的最适反应条件的相关信息；

（4）实验室具备完善的粗酶液纯化设备和仪器以及蛋白电泳设备；

（5）生科院实验室具备气相色谱仪、高效液相色谱仪、超高效液相仪-质谱检测器可以测定反应产物成分；

（6）实验方案设计较为合理，仪器设备完善，具有较高可行性。

4. 研究创新点

本研究通过对实验室具备的已经导入乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. RF-1酯酶基因的大肠杆菌进行诱导产生酯酶，并对酯酶进行提取、纯化。因为乳氟禾草灵以及乙羧氟草醚分子结构中都有两个酯键，而酯酶的功能即为断开酯键，因此本研究旨在通过对酯酶降解农药底物过程中反应产物的成分进行捕捉和检测，判断酯酶断开酯键的先后顺序或者是否只是断开其中一个酯键，从而分析该酯酶基因的功能进行研究并得出结论，期待可以推导并用于其他降解菌株中，增加其降解效率从而缓解环境农药污染问题。另外在本研究中对于气相色谱仪、高效液相色谱仪、超高效液相仪-质谱检测器等仪器有较多运用，能充分地丰富研究者仪器使用技能，可以说整个研究过程都是一次很有特色和研究价值的科研尝试。

5. 研究计划与进展

2018.11～2018.12：阅读相关文献，进行实验准备；

2018.12～2019.2：学习掌握实验原理，熟悉实验室环境，完成实验方案，进

行预备试验。