全文总字数：9988字
1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.研究意义
1.1 葡萄需求量大，但风味品质不理想，病虫害问题严重
葡萄是落叶藤本植物, 拥有着很高的经济价值，产量在全世界果品生产中仅次于柑橘，居于第二位[1]。与众多果树相比，葡萄适应能力强，容易繁殖，进入结果期早，三年基本可以实现丰产，适于在多种地形及贫瘠土壤上发展，对气候适应范围也较广，南北均可进行露地和设施栽培，故葡萄是脱贫致富、发展农村产业经济的重要树种，更满足发展庭院经济和美化环境的要求，故深受人们喜爱。但我国葡萄总体质量与国外相比较差, 效益不高, 故提高葡萄的品质成为提高经济效益的关键[2]。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
葡萄多酚含量不仅与果实风味品质相关，其不同品种的多酚及含量也决定着抗病性的强弱。本研究将选择10个抗性不同、成熟期不同的品种对其风味品质进行测定，并对其多酚进行提取，接种与灰霉菌上，观察不同品种间多酚对灰霉病的影响，初步揭示多酚对灰霉病的抗性与作用。
2.研究内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1 葡萄果实含糖量测定
随机将每种品种的约15粒葡萄样品平均分成三等分，剥皮后用打浆机或榨汁机打成匀浆，分装在3支离心管中，离心10min，再取上清液用电子数显式糖度仪测定其果实含糖量。
1.2 葡萄果实可滴定酸测定
选取各个品种成熟且外观完整、品质较好的果粒，去皮去籽，并在研钵中用液氮磨样后，准确称取4 g样品用蒸馏水洗入200ml烧杯中。加入150ml蒸馏水，定容后，盖上表面皿，置于75～80℃水浴上加热，期间不时用玻棒搅拌，30 min～40 min后取出，稍冷后，转移至离心管中，在4500r/min中离心10min,1~2次后合并上清液于烧杯中，并量取其体积用于滴定。加酚酞指示剂3～5滴，用0.05 mol·L-1的NaOH溶液滴定至淡红色，30 s内不退色为终点。
可滴定酸含量的计算通式为:
含酸量 / % = 100 × 10 － 3cVA VT MHnA /( mnVB )
其中: VA 为消耗NaOH标准液的体积(mL);c为NaOH标准液的浓度(mol·L－1)；m为样品鲜重(g)；VT为样品提取液总体积(mL)；VB为滴定用的提取液体积(mL)。1/n为酸碱物质的量之比，即1mol酸完全被中和所消耗的NaOH的物质的量(mol)。对单羧酸，n取1，二羧酸，n取2，余类推；折算系数则是用以计量的有机酸的摩尔质量，用MHnA表示(g·mol－1)；10－3为统一量纲时的换算系数。
1.3葡萄果肉、皮籽多酚的提取
①将各品种的果肉和皮籽进行完全分离，提取多酚分为葡萄果肉多酚和葡萄皮籽多酚；②果肉用液氮直接磨样，皮和籽先干燥（35~40℃烘干或风干）至恒重再用液氮磨样；③称取1 g样品于50ml离心管中（果肉1克；皮和籽按照籽：皮=1:2的比例称取1g样品）；④提前配置体积分数为50%的乙醇，并分别倒入20 ml于各离心管中；⑤置于水浴锅78℃中40~50min，期间不停震荡摇晃；⑥冷却后放入离心机，4500 r/min,10 min离心；⑦分离上清液和沉淀，若较浑浊或分离不彻底再重复⑥；⑧吸取上清液，其中移取0.5 ml上清液至50ml容量瓶,其余上清进行收集（为多酚粗提物）。此外，对于皮籽可向分离的沉淀中继续加入70% 丙酮溶液 10 mL，充分震荡后，再离心10 min，分离上清液和沉淀，而测定上清液中多酚含量，2次测定结果之和即为多酚含量； ⑨多酚的测定。在容量瓶中再加入30ml蒸馏水混合后，加入2 ml。
福林酚试剂，再混合均匀，3~8分钟后加入8 ml 10%的碳酸钠溶液，再用蒸馏水定容混合；⑩避光静置2小时后，用分光光度计在波长为760 nm处进行测定。
1.4 葡萄多酚抗病性检测
①采集合适的灰霉菌进行扩繁培养；②配置适宜生长的培养基并灭菌；③将同等量的灰霉接种到每个培养基上，并加入不同品种的等量葡萄多酚（每种葡萄的多酚至少2个平板，并注意空白对照）；④记录初始状态，此后每隔一段时间便对菌圈大小和形态进行测量和拍照记录，从而比较不同品种多酚对灰霉病的影响；⑤用显微镜观察菌丝状态，进一步描述多酚对病菌的抑制作用。
2.技术路线图（见最下面）
3.实验方案
3.1前期准备
在7~8月，前往郑州果树研究所选择合适的十种不同品种葡萄并对其果穗进行标记，在近成熟时每种采下3~4穗备用。采样后，需对其果粒进行挑选整理，剔除病虫害或烂熟品，先测定各品种的风味指标以及外观拍摄，再将各个品种果肉、果籽、果皮分离，果肉液氮磨样、籽和皮晒开（或烘干）后磨样冷藏备用。查阅资料后通过预实验，确定最合适的提取葡萄果肉、皮和籽的多酚的方法后，配好相关试剂准备进一步实验。
3.2 试验研究
每天对一个样品的果肉、果皮、果籽进行多酚提取，且做4次重复，并用分光光度计测定多酚含量后记录数据，再对数据合理的多酚进行收集，至少保证每种品种能收集果肉、果皮和籽分别50 ml以上多酚的粗提物，然后低温保存。
培养灰霉菌，制作培养基，并接种，再加入各品种等量提取的多酚进行病菌生长观察，包括显微镜下的菌丝生长和肉眼可见的菌圈变化等。
3.3分析数据阶段
每次试验，注意按时誊写试验数据，以便最终汇总方便。一项试验完成，应及时对数据进行处理，看结果是否合乎常理，数据是否有效可用，若不合理，则需再次重复试验。分析数据中需要结合SAS等软件，对其进行方差分析，以确定误差的大小；并好好利用excel等软件进行表格和图表绘制。
4.可行性分析
本试验处理材料的时间相对集中，尤其是成熟期多集中在7~8月，且需要跟踪测定，故需要合理安排时间，且完成毕业论文期间只涉及不超过两次葡萄生长周期，因此本研究对调查结果的准确性与耐心度有较为严格的要求，但由于本人SRT项目也是对果实品质方向的研究，故对糖酸等品质测定非常熟练，加之在实验室帮师兄们完成实验时，已接触过灰霉病的相关病理实验，故只需要认真且尽可能高效地完成多酚的提取即可。
在实验室方面，由本项目导师所在的实验室及课题组一直从事葡萄种质资源的保存、评价与品种选育工作，对品种选择和认知上已相对完备，该项目导师也一直从事着采后生理的研究，近期实验室对葡萄各种病害的研究也逐步深入，并且在果实品质和分子研究上作出了较多突破，加之有郑州果树研究所作为海量品种的挑选地，故有充分的基础进行相关试验。
4. 研究创新点
1.本研究将对葡萄质量和产量影响较大的灰霉病进行探究，利用葡萄自身提取物——可持续利用的次级代谢产物抑制病菌生长，有望替代环境污染大、对人体危害大的化学药剂或农药等，且更加高效安全。
2.提取了常见鲜食品种或不常见的科研种等共十种不同成熟期和抗病性的葡萄各个部位的多酚，并对其含量进行测定。
5. 研究计划与进展
1.2018年6月底~7月底
前期准备。查阅葡萄各部分多酚提取的方法，整理出实验室可操作的几种方法步骤，等待预实验后检验完善。关于葡萄灰霉病，尽可能多查阅文献，了解现有防治方法和水果多酚对它的抗病效果，从而完善试验方案和步骤，为后续试验做充分准备。
2.2018年7月中旬~8月中旬
课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
