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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
SPL（SQUAMOSA PROMOTERBINDING PROTEIN-LIKE）基因家族是高等植物中重要的转录因子，其具有高度保守的SBP结构域[1-2]，在植物生长发育中有重要的调控功能。多数SPL基因含有miR156的识别位点，能够被miR156调控，即miR156与SPL基因结合，抑制SPL基因的转录[3]。
通过miR156对于SPL基因转录翻译的调控，其参与调控植物生长发育过程中各种环节，如根系生长、叶片发育、分枝/分蘖生长、穗结构形成等[3-8],对于植物形态建成起重要作用：miR156过量表达会增加拟南芥侧根数目，抑制miR156的表达则会使拟南芥侧根数目减少，而miR156的靶基因 SPL3、SPL9、SPL10 过量表达都可以抑制侧根的生长[4]；在拟南芥中过量表达AtSPL10，可以使拟南芥叶片发生真叶由圆形转变为椭圆形、叶缘由光滑状转变为锯齿状等形态变化，此外，有研究表明At SPL9和At SPL10基因过量表达可以延缓叶片的生成速率[5-6]；SPL10过量表达会削弱拟南芥的顶端优势，使植株产生更多的分枝[7]。此外，SPL基因还参与植物激素信号转导、植物胁迫应答等过程[9]。
水稻作为世界上重要的粮食作物之一，通过分子育种的手段高效提升其产量及品质是当下亟待解决的关键问题。已有研究者对于水稻中的SPL基因功能进行了研究，过量表达OsSPL14基因的水稻株型更优、产量更高[3][7]；过量表达OsSPL16D可以促进水稻的细胞分裂、籽粒灌浆、籽粒的大小和形状[10]。
目前最主要的基因功能研究方法是通过CRISPR / Cas9基因编辑技术获得功能缺失突变体。CRISPR / Cas9技术由于其精确性和高效性等优势近年来受到广泛的关注。2012年CRISPR序列和Cas9蛋白共同构成了CRISPR / Cas9系统开始被用于活细胞、哺乳动物等的基因组编辑且应用范围日益广泛[11]。CRISPR / Cas9技术载体易于操作、效率高、细胞毒性小、可以一次作用于多个位点、成本低等[12]，具有明显的优势。CRISPR / Cas9技术的主要工作流程[13]是tracrRNA先与crRNA形成复合物，然后Cas9蛋白识别并结合复合物，继而引导crRNA鉴定和切割靶位点。后来，为了简化流程并提高效率，研究人员用sgRNA结构替换了tracrRNA-crRNA复合体。2014年，Shan等人[14]发表了CRISPR / Cas9系统在水稻和小麦中基因组编辑的操作流程，再次推动了CRISPR / Cas9技术在植物基因定点编辑中的应用。因此，我们可尝试利用CRISPR/Cas9来研究SPL2的基因功能。
本实验采用CRISPR/Cas9 技术对水稻中SPL基因家族中的SPL2基因进行靶向敲除，对水稻SPL2基因的功能进行研究。通过对突变体表型的观察以预测基因的功能。同时，探究SPL基因家族基因功能分化的模式，进而为提升水稻产量与品质、分子育种等提供新的思路。
| 参考文献： [1] Poethig R S. The past, present, andfuture of vegetative phase change. Plant Physiology, 2010, 154(2): 541-544. [2] Huijser P, Schmid M.The control ofdevelopmental phase transitions in plants. Development, 2011, 138(19):4117-4129. [3] Jiao Y,Wang Y,Xue D, Wang J,etal.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice.Nat Genet,2010.42(6),541-544. [4] Yu N, Niu Q W, Ng K H,et al.The role ofmiR156/SPLs modules in Arabidopsis lateral root development. Plant J, 2015，83 (4), 673-685. [5]Shikata M, Koyama T, Mitsuda N,et al.Arabidopsis SBP-box genes SPL10,SPL11 and SPL2 control morphological changein association with shoot maturationin the reproductive phase.Plant Cell Physiol,2009.50(12), 2133-2145. [6]Wang J W, Schwab R, Czech B, et al. Dualeffects of miR156-targeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron lengthand organ size in Arabidopsis thaliana.Plant Cell,2008,20(5):1231-1243. [7]Miura K, Ikeda M, Matsubara A,etal.OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice.NatGenet,2010.42(6),545-549. [8]李明,李长生,赵传志,等.植物SPL转录因子研究进展.植物学报，2013(01)： 107-116. [9]Zhang H,Zhai J, Mo J,etal.Overexpression of rice sphingosine-1-phoshpate lyase gene OsSPL1 intransgenic tobacco reduces salt and oxidative stress tolerance.J Integr PlantBiol.2012，54(9): 652-662. [10]Wang S, Li S, Liu Q,et al. TheOsSPL16-GW7 regulatory module determines grain shape and simultaneouslyimproves rice yield and grain quality. Science Foundation in China,2015,47(3):949-955. [11] LANDER E S.The Heroes of CRISPR [J]. Cell, 2016, 164(1–2): 18–28. [12] Voytas D F.Plant Genome Engineering with Sequence-Specific Nucleases.[J]. Annual Reviewof Plant Biology, 2013, 64(64):327-350. [13]O’CONNELLM R, OAKES B L, STERNBERG S H et.al. Programmable RNA recognition andcleavage by CRISPR/Cas9 [J]. Nature, 2014, 516(7530): 263–266. [14]SHAN Q,WANG Y, LI J et.al. Targeted genome modification of crop plants using aCRISPR-Cas system [J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(8): 686–688. |
2. 研究的基本内容和问题
1.1 研究目标
探究出水稻spl2基因在其生长发育过程中起到的作用，并通过生物信息学手段对其进行进化分析，以起到为提升水稻产量与品质、分子育种等提供新的思路的效果。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
·文献综合法：搜集整理相关文献，为研究做准备。
·实验法：落实到具体实验操作以得到实验结果。
4. 研究创新点
先利用生物信息学手段以预测水稻SPL2基因的具体功能，再利用反向遗传学中的CRISPR/Cas9 技术来验证推测，具体研究思路即首先通过CRISPR/Cas9技术对SPL2基因进行编辑，然后去发现随之而来的表型变化，如株高、分蘖数、叶片形状、颖片发育情况等，进而来确定基因功能，得出实验结论。
5. 研究计划与进展
①2018年9月-10月：阅读相关文献，理解实验相关知识。
②2018年11月：对查阅的文献进行整理总结，完成开题报告。
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