单增李斯特菌感染小肠隐窝类器官的分子机制研究开题报告

全文总字数：3492字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

单增李斯特菌（listeria. monocytogenes）是一类重要的食源性致病菌，可引起人类脑膜炎、败血症及孕妇流产等严重疾病，尤其是老人、新生儿及孕妇等免疫力低下者对单增李斯特菌更易感，感染后死亡率高达30%。

该菌既可侵染吞噬细胞，也可感染上皮细胞、肝细胞等非吞噬细胞，在宿主细胞中，单增李斯特菌能够分泌毒力因子李斯特菌溶胞素（listeriolysino, llo）和磷脂酶去裂解吞噬体膜，从而使单增李斯特菌进入宿主细胞的细胞质中。一旦进入胞质，单增李斯特菌就会开始快速增殖并启动肌动蛋白聚合酶（acta）的表达。acta聚合宿主细胞的肌动蛋白，形成彗星状的肌动蛋白尾，驱使单增李斯特菌在胞质内运动，进而感染相邻细胞^[1]。

当单增李斯特菌感染宿主细胞进入细胞质后，细菌的病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，pamp)、菌体蛋白、毒力因子和核酸等可被宿主细胞质中的不同炎性体识别并激活，进而活化 casepase1，促进 il-1β 和 il-18 的成熟和分泌，以及 casepase1 依赖的细胞死亡。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

通过研究单增李斯特菌体外侵袭小肠类器官模型时单增李斯特菌胞内外的侵袭率，细胞形态受损程度，细胞出芽和死亡程度以及干细胞和免疫细胞在基因水平上的变化，观察单增李斯特菌的侵袭过程，类器官形态学和基因水平上的变化，探究宿主-病原体的相互作用。

3. 研究的方法与方案

研究方法及实验方案：

1.小肠隐窝类细胞的分离

取小鼠部分肠段，在4℃pbs中进行清洗，清理完毕后，剪成小肠碎片，多次pbs摇洗，再用消化液消化，使隐窝细胞与肠段结合松散，消化结束后，再用pbs清洗摇晃，使隐窝细胞进入溶液中，随后用滤膜过滤除去小肠碎片，得到小肠隐窝细胞沉淀，通过镜检确定是否为隐窝细胞。

4. 研究创新点

目前大多数研究是关于单增李斯特菌的胞内毒力效应和单增李斯特菌引起的宿主先天性免疫应答以及用小肠类器官作为体外模型研究一些作用机理，但目前还没有单增李斯特菌侵袭小肠类器官，单增李斯特菌对小肠上皮细胞作用的相关研究，所以本实验是对其进行初步探索，建立单增李斯特菌体外侵袭模型。

5. 研究计划与进展

2018.10-2018.12 相关文献的阅读以及初步技术路线以及方案的整理

2018.12-2019.2 小肠类器官的体外培养，单增侵袭小肠类器官模型的构建

2019.2-2019.4 对单增侵袭模型表型及细胞增殖相关基因的初步探究