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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、课题意义
鲜切果蔬是一种方便、新鲜、安全的产品，因其多种优点在我国迅速流行起来。鲜切西瓜则是鲜切果蔬中的代表性产品。西瓜糖分的组成和含量是决定其品质的关键因素，其中蔗糖是西瓜中糖积累的主要形式，是影响西瓜品质形成的重要因素。蔗糖合成酶在调控西瓜的蔗糖代谢中发挥着重要作用，糖代谢及其相关酶调控与西瓜品质形成密切相关。因此研究鲜切西瓜在低温贮藏中蔗糖的作用与含量变化、蔗糖合成酶与蔗糖含量的关系以及蔗糖合成酶及基因的变化，有利于更深层的理解和揭示鲜切西瓜中蔗糖与蔗糖合成酶的关系，为提高鲜切西瓜贮藏品质提供理论依据和指导。
2. 研究的基本内容和问题
一、研究的目标及内容：
1、明确低温贮藏期间鲜切西瓜蔗糖含量的变化。
3. 研究的方法与方案
一、技术路线及实验方案
二、研究方法
1.硬度的测定，采用硬度计测量样品硬度
2.可溶性固形物含量的值测定，取西瓜鲜样50g研磨,用四层纱布过滤取滤液，采用糖度计（Atago, PAL-1, Tokyo, Japan）测定。
3.蔗糖含量的测定：取2g西瓜粉末，加入20ml去离子水， 80℃水浴30分钟，抽滤，定容至25ml。取上清液过 0.45-mm HPLC尼龙网滤膜（MEMBRANA,Germany）。配备示差折光检测器(RID-10A, SHIMADZU, Japan)的高效液相测定糖含量。柱子型号InertSustain NH2-5μm（Japan），流速1ml/min，温度30℃，进样量20μl。液相条件为：ZORBAXSB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为 0.025molmL-1 pH 2.4的KH2PO4-H3PO4缓冲溶液；流速0.5mLmin-1；柱温30 ℃；进样量20μL。4．酶活性的测定：（1）酶液提取，称取2.0g西瓜果肉，置于预冷的研钵中，分批加入5mL提取缓冲液（100mmol/L Tris-HCl（pH7.0）缓冲液），（内含5mmol/L MgCl2，2mmol/LEDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠），体积分数2%的乙二醇，质量分数0.2%的BSA（牛血清白蛋白），质量分数2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），5mmol/L DTT（二硫代苏糖醇））。冰浴研磨提取，2℃下10000r/min离心20min，取上清液3mL装入透析袋中，置于透析缓冲液（25mmol/L Tris-HCl（pH7.0）缓冲液，（内含2.5mmol/L MgCl2，1mmol/LEDTA-Na2，体积分数1%的乙二醇,1mmol/L DTT）中4℃透析过夜，其间更换3次透析液，透析后酶液定容至5ml备用。
（2）SPS（蔗糖磷酸合成酶）的测定:向0.4ml100mmol/L Tris-MES（pH7.0）反应体系中（内含10mmol/L果糖-6-磷酸，5mmol/L醋酸镁，5mmol/L DTT）加入0.1ml UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖)和0.05ml透析后酶液，补蒸馏水至1ml，于30℃水浴中反应10min后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。然后加入2mol/L NaOH 0.1ml，沸水浴10min后冷却至室温。加体积分数30%的 HCl 3.5ml，质量分数0.1%的间苯二酚1ml，摇匀后80℃保温10min，冷却后于480nm处用分光光度计测OD值，测定蔗糖生成量。酶的活性单位用μmol/（h·g）表示。
（3）SS（蔗糖合成酶）的测定与SPS的测定方法类似，只是酶反应液中用10mol/L果糖代替果糖-6-磷酸。
5．鲜切西瓜SPS和SS基因相对荧光定量检测
总RNA的提取及cDNA（互补DNA）第一链的合成：
（1）总RNA的提取采用TaKaRa公司产品MiniBEST UniversalRNA Extraction Kit试剂盒。
将新鲜的或超低温冻存的植物组织样品迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒）。将研磨成粉末状的样品加入到含有500μl裂解Buffer RL的1.5ml灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。
（2）将裂解液在12,000 rpm，4℃离心5分钟。
（3）小心吸取上清液到新的1.5ml RNase Free Tube中。
（4）将gDNA EraserSpin Column安放到2ml的Collection Tube上。
（5）将上清液转移入到gDNAEraser Spin Column中。
（6）12,000 rpm，离心1分钟。
（7）弃gDNA EraserSpin Column。保留2ml Tube中的滤液。
（8）向上述步骤3或步骤7中加入液体1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。
（9）立即将混合液（含沉淀）全部转入到 RNA Spin Column（含2ml Collection Tube）中。（如果混合液的体积大于600μl，请分批加入，每次加入的体积不要大于600μl。）
（10）12,000 rpm离心1分钟弃滤液。将RNASpin Column 放回到2 mlCollection Tube中。
（11）将500μl BufferRWA加入至RNA SpinColumn中，12,000 rpm离心30秒，弃滤液。
（12）将600μl BufferRWB加入至RNA SpinColumn中，12,000 rpm离心30秒，弃滤液。
（13）重复操作步骤（12）。
（14）将RNA Spin Column重新安置于2 ml Collection Tube上，12,000 rpm离心2分钟。
（15）将RNA SpinColumn安置于1.5 ml的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央处加入50～200μl的RNase Free dH2O或 0.1% DEPC处理水，室温静置5分钟。
（16）12,000 rpm离心2分钟洗脱RNA。
（17）若想提RNA的收量，可再向RNA Spin Column 膜中央加入50～200μl的RNase Free dH2O或0.1% DEPC处理水洗脱RNA；若要得到高浓度的RNA，也可以将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column中，室温静置5分钟，12,000 rpm离心2分钟洗脱RNA。进行1%琼脂糖凝胶电泳和测定A260、A280、A230的吸光值，检测RNA质量和完整性。
RNA质量稳定后用PrimeSciptTM RT Master Mix试剂盒（TaKaRa，Japan）去除DNA杂质并合成cDNA。具体操作方法如下：
（1）按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 5×PrimeScriptRT Master Mix（PerfectReal Time） | 2μl | 1x |
| Total RNA | * |
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| RNase Free dH2O | up to 10μl |
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（2）轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：37℃，15 min（反转录反应）；85℃，5 sec（反转录酶的失活反应）；4℃。
以18S RNA基因作为内参，引物对为F5＇-TATGGTTCCTTTGGTCGCTC-3＇，R5＇-CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3＇。采用 Primer Premier5. 0设计CmSS1、CmSS2、CmSS3、CmSS4、CmSPS1、CmSPS2 、CmSPS3的引物。（表1）（见附件）
使用Applied Biosystems公司的q-RTPCR仪7500开展RT-PCR检测，具体操作方法如下：
（1）按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）
| 试剂 | 使用量 | 使用量 | 终浓度 |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2×) | 10.0 μl | 20.0 μl | 1× |
| PCR Forward Primer (10μM) | 0.4 μl | 1.0 μl | 0.2 μM*1 |
| PCR Reverse Primer (10μM) | 0.4 μl | 1.0 μl | 0.2 μM*1 |
| ROX Reference Dye II (50×) *2 | 0.4 μl | 1.0 μl | 1× |
| DNA 模板*3 | 2.0 μl | 4.0 μl |
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| dH2O (灭菌蒸馏水) | 6.8 μl | 18.0 μl |
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| Total | 20.0 μl*4 | 50.0 μl*4 |
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（2）进行 Real TimePCR 反应：采用两步法PCR反应程序
Stage 1：预变性——Reps：1；95℃，30秒。
Stage 2：PCR反应——Reps：40；95℃，5秒；60℃，34秒；最后用2－ΔΔCT法对结果进行数据分析。
4. 研究创新点
一、本实验对鲜切西瓜中蔗糖合成酶与蔗糖含量进行了初步研究探讨。
二、本实验对鲜切西瓜中蔗糖合成酶及其基因进行了初步研究探讨。5. 研究计划与进展
2018.7-2018.8文献查阅翻译和安排实验进程。
2018.9-2018.10 预实验摸索最佳实验条件及方案修改。
2018.10-2019.2进行正式实验
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