不同超声条件对乳酸菌发酵苹果汁的生长及产酸性能的影响开题报告

全文总字数：4185字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1果蔬汁发酵

我国是世界上最大的果蔬原料生产国^[1]，发酵型果蔬制品在人们的日常饮食中有着举足轻重作用。果蔬发酵不仅是一种延长果蔬产业链的重要技术，也是提升果蔬营养功能的手段。植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)在果蔬发酵领域应用广泛，如果蔬汁的发酵和泡菜的制备、葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵等。

1.2乳酸菌

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究内容

低强度超声波对植物乳杆菌代谢有机酸的影响。选取富含有机酸的苹果汁作为研究材料，采用实验室保藏的植物乳杆菌作为发酵剂，苹果汁中进行密闭发酵。在发酵的不同阶段采用脉冲低场强功率超声波处理菌液，然后监测菌体生长情况，同时分析菌体细胞膜的通透性、流动性、细胞内外形态变化。采用超高液相色谱并联质谱鉴定发酵液中有机酸及其衍生物的种类，并检测有机酸及其衍生物含量的变化。采用超高液相色谱并联质谱鉴定发酵液中有机酸及其衍生物的种类，并检测有机酸及其衍生物含量的变化。

2.2研究的目标

3. 研究的方法与方案

3.1研究方法

发酵技术：采用低场强功率超声波辅助植物乳杆菌发酵。

发酵液组分分析：HPLC/Triple-TOF-MS鉴定酚酸及其衍生物种类；采用HPLC测定酚酸及其衍生物、苹果酸、乳酸、乙酸、葡萄糖的含量；采用HS-SPME-GC-MS测定乙醇的含量；采用氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸的种类和含量；采用ABTS、DPPH和FRAP法测定发酵液的体外抗氧化活性。菌体生理、生化分析：采用流式细胞术分析菌体细胞膜通透性；采用荧光探针标记法分析菌体细胞膜流动性；采用原子力显微镜分析菌体表面形态；采用透射电镜分析菌体细胞内形态；

3.2技术路线

3.3实验方案

3.3.1低场强功率超声波辅助植物乳杆菌发酵条件建立

LactobacillusplantarumBNCC337796冻干粉购于北京北纳生物保藏中心，在MRS肉汤中于37℃下活化24h。一方面，将培养液与50％的甘油混合，储藏在-20℃下长期保存。另一方面转接到斜面培养基上，37℃下培养24h后放置于4℃下短期保存，用于整个研究中的种子液制备菌种。挑取斜面菌落接种于50mL无菌MRS肉汤中，37℃培养24h后作为活化的种子液使用。将已活化的种子液以2％的接种量接种到苹果汁中，于30℃下发酵。超声辅助植物乳杆菌发酵苹果汁条件：频率为20KHz，超声探头位于液面以下约1cm，分别在接种后0h，8h，18h（潜伏期、对数期、稳定期）超声处理30min，模式为5s开，5s关。设置两个不同的超声强度：58.3W/L和93.6W/L。以同样条件下不采用超声处理发酵的的苹果汁作为对照。取发酵0h，超声后0，6，12，24h的样品测定糖、有机酸等指标。

3.3.2低场强功率超声波辅助植物乳杆菌生理状态分析

于发酵后0h，超声后0,2,4,6,12,24h分别取样，采用平板菌落计数测定不同阶段发酵液中的植物乳杆菌数量，结果以CFU/mL表示。

3.3.3低强度功率超声场下植物乳杆菌有机酸代谢组分分析

有机酸含量测定采用Lima等的方法，并有所修改。采用液相色谱法测定，具体方法如下：色谱柱为安捷伦TC-C18柱（4.6*25mm，5μm）；检测波长：210nm；流动相：0.08MKH2PO4溶液（用磷酸调pH至2.9）进行等梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.7mL/min，进样量：20μL。采用标准品获得保留时间和标准曲线对发酵液中单体糖进行定性和定量。结果表示mg/mL。

3.3.4低强度功率超声场下植物乳杆菌糖代谢组分分析

糖含量测定采用液相色谱法，参照Vervoort等方法，并有所修改。采用安捷伦1200系列液相色谱仪，外部连接Alltech3300蒸发光散射检测器（ELSD）。色谱柱PrevailcarbohydrateEScolumn（250mm×4.6mm，5μm），连接一个PrevailC18柱（7.5mm×4.6mm，5μm）作为保护柱。柱温：30℃；流动相：乙腈：水（75:25，v/v）；流速：1mL/min；运行时间：23min。漂移管温度：80℃；氮气流速：1.5L/min。进样量：10μL。采用标准品获得保留时间和标准曲线对发酵液中单体糖进行定性和定量。结果表示mg/mL。

3.4可行性分析

目前，低场强功率超声波已被多篇文献证实可促进微生物的生长和代谢，提高发酵产品的品质，主要原因与超声空穴作用相关。超声空穴气泡作用于微生物细胞膜，可改变细胞膜的通透性，进而导致细胞代谢的改变，带来一系列积极的影响。但是，低场强功率超声波对微生物细胞代谢的影响机制目前并不清楚。研究发现，将低强度功率超声波应用于植物乳杆菌发酵苹果汁的过程中，可促进微生物的生长，提高乳酸的生成量，并促进苹果汁中酚酸类物质的代谢，同时，超声处理的发酵苹果汁抗氧化能力和感官品质也优于未超声处理的样品。另外，申请人所在南京农业大学农产品加工课题组已建立成熟的蛋白质组学和转录组学研究方法，研究成果发表于FoodChemistry、JournalofProteomics等杂志中。这些前期研究均为本项目的顺利开展奠定了良好的工作基础。

4. 研究创新点

本项目首次提出将功率超声波技术用于植物乳杆菌生物转化有机酸过程中，促进风味及功能性有机酸衍生物的生成，从而提高发酵果蔬制品的品质和功能，推动功能性果蔬制品的研发。

5. 研究计划与进展

5.1 2019年1月至2019年3月

分析超声波辅助植物乳杆菌代谢过程中发酵液有机酸、葡萄糖和氨基酸的变化。

5.2 2019年4月至2019年5月