资源浓度对根际细菌互作关系的影响研究开题报告

全文总字数：5776字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

番茄青枯病是一种毁灭性的土传病害，在我国主要分布在长江以南，严重制约着我国番茄产业的健康发展[1]。植物根际促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，pgpr）作为农业生产上最具有应用价值的一类微生物，能在很大程度上抵御土传病原菌对根系的侵染。随着对微生物群落与病原菌互作关系研究的开展，越来越多的研究结果表明，微生物的多样性越高，群落利用资源的效率越高 [2]或群落产生更多拮抗物质 [4]，可能越有利于提高群落抵抗病原菌入侵的能力。但并不是多样性高的群落的抗入侵能力一定高，环境条件改变或群落构成不合理可能使群落内的相互竞争作用增强，反而削弱了群落的整体功能的发挥。贺纪正等（2013）也认为微生物多样性对功能稳定性的影响不存在通用模式，多样性与稳定性之间的关系还有待深入开展研究[11]。

pgpr群落多样性有利于提高土传病害的防控效率，但pgpr菌群稳定抵御病原菌入侵的机制尚不清楚。人们在使用pgpr防控土传青枯病害时，普遍发现大田应用效果远不及盆栽或温室条件下的效果稳定。原因可能归结为大田中变化不定的环境条件，如：温度[6, 7]、ph值以及资源水平[8]，使得pgpr 对“陌生”环境不适应，从而使pgpr菌群抵抗能力下降或未达到最大化。其它生物或非生物因子也可能导致生防菌防效不稳定，haas和défago认为生防菌防效不稳定是因为其抗病特征（产生铁载体和抗生素）没有表达，而这些基因的表达也受环境因子的影响[10]。

环境中的资源浓度是影响作物生长和青枯菌生长的关键因子之一，深入探究这一因子对病原菌以及生防菌、协同菌生长状况的影响可以使我们更好地了解资源水平对根际微生物相互作用的影响机制[12]。yang等认为，环境中可利用的资源水平会影响根际微生物的互作模式，通过改变群落间的竞争关系从而影响微生物群落多样性[8]。目前关于pgpr群落稳定抵御青枯菌入侵植物根际的机制尚不清楚，根际微生物多样性与稳定性的关系亟需进一步研究。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标

1)研究实验室培养na营养条件下土著细菌t-5、wr21对入侵细菌rs-rfp生长的抑制作用效果；

2)探索不同资源浓度（na、50na、20na，10na）分别对t-5、wr21、rs-rfp生长的影响以及不同资源条件下t-5、wr21对入侵细菌rs-rfp生长的影响；

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法

1)土著细菌对青枯菌生长的影响研究：采用微孔板共培养系统测定两株土著细菌（生防菌T-5和WR21）分别对Rs的促进/抑制能力，设置不添加土著细菌的对照以及不加任何细菌的空白对照；

2)资源浓度对细菌生长的影响研究：采用微孔板系统，分别在不同资源水平（NA、50NA、20NA，10NA）下培养细菌，检测细菌各细菌生长曲线；

3)不同资源浓度下土著细菌两两互作关系研究：主要利用微孔板系统，检测一种细菌A对细菌B生长的影响：根据两者生长（OD600）相互影响情况，判断土著菌株间互作关系；

4)不同资源浓度对群落互作关系特征与群落抵御土传青枯菌侵染能力关系的影响：利用微孔板系统研究不同资源浓度下群落抵御土传青枯菌入侵的能力，分析不同资源浓度下菌株两两之间互作关系对群落抵御青枯菌入侵的影响。

2. 技术路线

不同资源水平对根际细菌生长的影响

构建高效稳定菌群

资源浓度对根际细菌互作关系的影响研究

不同资源水平下土著菌之间互作关系及其对病原菌入侵的影响

3. 实验方案

1）首先在NA液体培养基中培养2株土著细菌到48小时，离心菌液，并进行过滤除菌收集2株土著细菌发酵液备用。在96孔板系统中加入NA培养基以及调好OD的2株土著菌菌液和调好OD的病原菌菌液，测定2株土著菌菌体病原菌生长的影响；在96孔板系统中加入1/5 NA培养基以及2株土著菌发酵液和调好OD的病原菌菌液，测定2株土著菌发酵液对病原菌生长的影响。

2）采用微孔板系统将两种土著细菌分别和病原菌在不同资源水平（NA、50NA、20NA，10NA）下进行共培养（初始接种数量为1.0*10⁷cfu/ml，细菌A和B接种浓度相同）

3）其次将2株拮抗菌共培养，然后每隔4小时测一次OD600，比较两株菌的生物量，看彼此之间相互作用

4）采用微孔板系统将2株土著细菌在不同资源水平（NA、50NA、20NA，10NA）下进行共培养（初始接种数量为1.0*10⁷cfu/ml，细菌A和B接种浓度相同），同时接种病原菌（初始接种数量为1.0*10⁶cfu/ml），培养72小时，利用酶标仪检测不同时期病原菌红色荧光蛋白强度（激发波587nm,发射波610 nm）。

5）实验用到NA培养基配方：10g葡萄糖，5g蛋白胨，3g牛肉膏，0.5g酵母粉，去离子水加至1L，115℃灭菌30min。

4. 可行性分析

1)课题采用的研究方法成熟，设计的技术路线合理。指导教师具有丰富的科研经验。其在植物土传病害的生物防治研究方面具有长期的研究积累，相关成果先后获得过中国发明专利金奖和国家技术发明奖二等奖。

2)课题依托南京农业大学资源与环境科学学院植物营养系，具有坚实的研究基础和完善的仪器设备条件。

以上有利条件均为本项目的顺利完成提供了保障。

4. 研究创新点

本研究以不同于以往在青枯菌拮抗菌中寻找对抗青枯病机制的角度，而是从青枯菌有益菌入手，探索在不同进程、不同区系组合下对青枯菌的生长状况的影响，希望能为之后揭示出青枯菌有益菌促进青枯菌生长的深入机理提供帮助，为开发出新的防控手段打下基础。

5. 研究计划与进展

1.研究计划

2018.12-2019.02 查阅文献资料，准备实验材料，学习基本实验操作技术；

2019.03-2019.04 青枯有益菌在不同时间中对青枯菌数量变化的影响实验；不同资源梯度下人工构建的细菌区系对青枯菌的生长状况的影响实验；