有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响开题报告

 2022-01-16 19:53:59

全文总字数:10951字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

1.选题背景及研究现状

1.1抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,args)污染研究现状

1.1.1耐药菌的产生

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2. 研究的基本内容和问题

3.研究的目标、内容和拟解决的关键问题

3.1研究内容

依据实验方案,选择三种有机氯农药(ddt、hch、氯丹)在不同浓度范围对供体菌(hb101)和受体菌(jm108)进行接合实验,筛选接合子,计算接合率,提取接合子dna进行验证。

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3. 研究的方法与方案

4.究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

4.1.研究材料及技术路线

4.1.1实验材料

(1)供体菌HB101

卡那霉素抗性(KmR)、氨苄霉素抗性(AmR)、四环素抗性(TcR)其物理与遗传图谱见图1.1。

(2)受体菌JM108

萘啶酮酸抗性(NaR);由于IS186转座子的插入,缺乏离子蛋白酶表达;基因型为:endA1 recA1 gyrA96 thi-1 relA1 glnV44 Δ(lac-proAB)hsdR17(rK-mK )。

(3)三种有机氯农药

名称

英文名称

分子式

溶解度

相对分子量

六六六

Hexachlorocyclohexane

C6H6Cl6

0.7mg/L

290.82

DDT

2,2-bis(4-Chlorophenyl)-1,1,1-trichloroethane

C14H9Cl5

1.2×10-3mg/L

354.5

氯丹

Chlordane

C10H6Cl8

不易溶于水

409.78

(4)抗生素储备液

名称

英文名称

分子式

浓度

溶剂

萘啶酮酸

Nalidixic Acid

C12H12N2O3

20mg/ml

无菌水

卡那霉素

Kanamycin

C18H38N4O15S

20mg/ml

无菌水

抗生素溶液配制完成后,需要用0.22μm水相滤头过滤除菌,分装保存于-20℃保存,保存时间不超过一周。使用前,于室温下融化,吸取适量于培养基中。

(4)培养基

a.LB培养基:

胰蛋白胨10g;酵母粉5g;NaCl 10g;水800ml.

加热使之完全溶解,然后加水定容至1L。

分装于三角瓶中,高压121℃下灭菌15min,冷却备用。

b.LB琼脂培养基:

胰蛋白胨10g;酵母粉5g;NaCl10g;水800ml;12g琼脂粉

加热使之完全溶解,然后加水定容至1L。

分装于三角瓶中,高压121℃下灭菌15min,冷却备用。

使用时,加热使之溶解,冷却至50℃左右再加入抗生素混匀。

c.细菌滤膜

将0.22μm的滤纸,剪成直径1~2cm大小,放在玻璃平板中,用报纸包好灭菌,烘干。

(6)其他试剂

a.生理盐水:0.85%的NaCl水溶液,121℃灭菌15min,冷却备用

b.甲醇

c.PBS缓冲液:

NaCl 137mmol/L ; Na2HPO4 10 mmol/L ; KCl 2.7mmol/L

KH2PO42mmol/L ; pH 7.4

121℃灭菌15min后冷却备用

(7)细菌质粒提取试剂盒

(8)PCR试剂:Taq Mix

(9)琼脂糖电泳试剂:

琼脂糖,Tris-硼酸(TBE)缓冲液

4.1.2技术路线

4.2.实验方案

4.2.1受体菌和供体菌对抗生素耐受浓度测定实验

a.实验目的:两种抗性菌分别对两种抗生素的最高耐受浓度

b.实验步骤:

分别将供体菌、受体菌接种在2支装有5mlLB培养基的试管中,37℃振荡培养12h。

分别吸取0.1ml菌液,涂布到含不同浓度抗生素的平皿上,供体菌实验组的卡那霉素素浓度分别设置为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85mg/mL,受体菌实验组的萘啶酮酸浓度分别设置为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105mg/ml。37℃恒温培养,分别菌落计数。

细菌计数采用平板倾注培养计数法,通过计算存活率,拟合到四参数的logistic方程中,从而计算得到半抑制浓度)以下为实验、数据处理方法:

操作:向已灭菌的平板中倒入约10ml已灭菌融化的含有不同浓度的抗生素LB琼脂培养基,抗生素于50℃左右再加入LB培养基,待冷却至约45~50℃时,取0.1ml菌液接种于灭菌平板,每个样本3个平行,轻轻转动平板,使菌液与抗生素混合均匀,冷凝后将平板倒置于37℃恒温培养24h,按照细菌活菌平板计数方法进行计数。

数据处理:

存活率

存活率(%)=Nij/N0×100%

式中,

Nij:加入抗生素j的第i实验组的单位体积菌液的菌落(CFU·mL-1),抗生素j包括卡那霉素和萘啶酮酸;

N0:对照组(即无抗生素平板)的单位体积菌液的菌落(CFU·mL-1

剂量效应与半抑制浓度

四参数Logistic方程用于拟合抗生素对菌液中总菌群的剂量效应曲线。四参数Logistic方程如下:

存活率(%)=(A1-A2)/[1 (x/x0p] A2

式中:

A1:无抗生素添加的效应值,设定初始值为100;

A2:抗生素添加足够多时的效应值,设定初始值为0;

x0:半抑制浓度(mg·L-1),即IC50

x:添加的抗生素浓度(mg·L-1);

p:曲线坡度参数

将存活率和相对应的抗生素浓度输入软件Origin8.0,选择药物剂量效应S曲线拟合,获得菌液中总菌数对于相应抗生素的半抑制浓度。

4.2.2细菌的培养和接合转移实验

(1)菌液培养

将两个抗性菌株接种于2支装有10mlLB培养基的试管中,在37℃下振荡培养12h(加相应抗生素)、用PBS缓冲液离心清洗三次;测定OD600,调整菌液至特定浓度。

(2)混合接触

吸取等体积的供体菌、受体菌悬液于2ml EP管中,加入等体积不同浓度的有机氯农药(用甲醇稀释),轻轻搓转,动作要慢,使供体菌和受体菌充分接触,同时避免刚接触的配对又被分开,混匀后,涂布至含有滤膜的培养基上37℃恒温静置培养。用无机盐冲洗滤膜定容梯度稀释得到的接合反应后的菌悬液。

同时设四个对照组:

1.受体菌、供体菌分别在最高浓度的有机氯农药的培养基中培养;

2.受体菌在无农药污染,单抗的培养基中培养;

3.因为农药由甲醇溶解,设置不加农药的情况下,加入最大体积的甲醇在培养基中培养。

(3)涂布筛选

将混合菌液涂布于含两种特定抗生素的双抗琼脂平板,待凝固后,37℃培养18-24小时,计数菌落数。

设置的四个对照组与目的实验的操作相同,以保证实验条件相同。

4.2.3接合转移频率的计算

接合转移频率是表征接合转移质粒(耐药基因)发生的程度,一般表示为单个受体菌细胞能发生接合转移的细胞个数。接合转移频率按照公式(1.1)计算:

F=NO·T/NO·R公式(1.1)

f:接合转移频率

No.T:接合子数量(CFU/ml)

No.R:受体菌数量(CFU/ml)

4.3可行性分析

4.3.1与本项目有关的研究工作积累和已有的研究工作成果

该实验相关人员进行了文献调查和学习,对有机氯农药、细菌耐药性、基因的接合转移有了基本的了解和认识,并且具有相关的实验经验。

本项目的指导老师为刘娟老师,指导老师可以科学合理的解决实验过程中遇到的问题并进行指导,从而能确保本课题的顺利完成。

4. 研究创新点

5.特色或创新之处

本研究首次基于细菌耐药性和基因的接合转移,探究有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响。

5. 研究计划与进展

6.研究计划及预期进展

2019.01.08之前

查阅相关文献资料,完成开题报告;

2019.01.09-2019.01.17

采购所需药品,完成预实验;

2019.02-2019.04

完成细菌接合转移实验、进行质粒检验、功能验证;

2019.05

对数据进行分析总结,撰写论文及结题报告。

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