构建水稻体内细胞分裂素信号可视化检测系统开题报告

全文总字数：4578字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

细胞分裂素是植物体内重要的调控因子，与植物的生长、发育有密切联系 (skoog et al.,1957)。研究表明，细胞分裂素作为植物体内调控氮素吸收、转运与代谢的主要长距离传递的信号因子之一，对植物的形态、生理及产量有重要调控作用（李志康等,2018；gu et al.,2018）。因此，细胞分裂素信号可视化检测系统对于明确植物体内细胞分裂素在不同部位的浓度对植物发育的研究有着重要意义。近年来的研究表明, 植物体内细胞分裂素的信号传导机制是一种类似于细菌和真菌中双元组分系统的磷酸接力反应(刘长洲等，2012； hwang et al.,2002)。目前，人们对拟南芥中细胞分裂素的信号传导途径已十分明了，一般包含以下四个步骤：首先细胞分裂素受体组氨酸蛋白磷酸酶hks结合细胞分裂素后自磷酸化，并将磷酸基团有激酶区保守的组氨酸残基转移至信号接收区保守的天冬氨酸残基上；其次天冬氨酸上的磷酸基团被传递到细胞质中的磷酸转运蛋白hps上，然后磷酸化的磷酸转运蛋白进入细胞核并将磷酸基团转移到type-b rrs响应因子上，最后再正向调控type-a rrs和下游响应细胞分裂素基因的表达，但是type-a rrs基因的表达具有反馈抑制type-b rrs响应因子的作用（hwang et al.,2012）。但人们对于植物体内不同时期不同部位的细胞分裂素信号传导的情况不是非常清楚。主要原因是植物体内细胞分裂素浓度的难以测定，而且物体内活性态的、结合态的细胞分裂素及其它代谢产物含量水平是非常低的，甚至在同一个植物部位的细胞分裂素比生长素低上百倍（werner et al., 2006）。因此构建一个可视化的细胞分裂素报告系统使我们能够方便的得到不同植物部分细胞分裂素的浓度情况，对我们进一步明晰细胞分裂素的作用机理奠定了基础。目前在拟南芥中使用一个人工合成的报告元件（tcsn）可以去检测细胞分裂素转录水平的信号输出，能很好的在野生型的植物生长过程中观察到细胞分裂素的作用的位置（mülleret al.,2008）。因此我们想利用此元件构建水稻里的细胞分裂素报告系统。水稻不仅是世界上主要的粮食作物，而且水稻基因测序已经全部完成，理论上水稻可以被当做单子叶模式植物（sasaki et al., 2002）。而探究细胞分裂素在水稻内的功能将有望为粮食增产提供理论基础，构建水稻体内细胞分裂素信号可视化检测系统将为其提供强有力的研究手段

1.参考文献

2.李志康,严冬,薛张逸,顾逸彪,李思嘉,刘立军,张耗,王志琴,杨建昌,顾骏飞.细胞分裂素对植物生长发育的调控机理研究进展及其在水稻生产中的应用探讨[j].中国水稻科学,2018,32(04):311-324；

2. 研究的基本内容和问题

前人对植物中细胞分裂素作用机制的研究情况已作出颇有建树的工作，即在模式双子叶植物拟南芥中已报道一个可以检测细胞分裂素信号传导的人工合成报告元件（TCSn::GFP）能够很好的反映出细胞分裂素作用部位和功能的强弱。但它是否同样能在单子叶植物里检测细胞分裂素的信号传导尚不清楚。因此，我们的研究目标是依据前人的基础创建一个能够用于单子叶植物细胞分裂素检测的人工合成元件。对于目标单子叶植物的选择，我们选择了基因组测定完成的“模式植物”水稻。期望为未来粮食增产提供基础。细胞分裂素调控细胞的分裂需要依赖细胞分裂素的信号传导途径，而植物体内的细胞分裂素的信号传导机制是一种类似于真核生物和原核生物中的双元组分系统的磷酸转移反应。定位在核里的Type-B RRs是响应磷酸信号的正向转录因子，可以正向的启动Type-ARRs的表达，但也会受到Type-ARRs的反向抑制。不过在Type-ARRs家族的启动子区域内含有与Type-B RRs转录因子结合的保守DNA序列，经过一系列的体外试验验证发现 (A/G)GAT(T/C)是主要的核心碱基序列。因拟南芥和水稻之间有着一定的差异，故拟解决的关键问题如下：①对于植物中细胞分裂素的信号转导途径Type-B RRs作为信号响应下游，调控着下游基因的表达。同时也能激活type-ARRs的表达。因此我们需要分析比对水稻中Type-B RRs基因与拟南芥中功能结构域是否一致，保守性是否符合要求。 ②水稻中type-ARRs家族序列对不同细胞分裂素响应规律，并与报告元件对不同细胞分裂素的响应规律进行对比，以此验证报告元件的可靠性。③我们拟利用GUS基因来做报告元件, 构造强化后的细胞分裂素报告系统后，我们需要通过实验观察GUS基因的表达是否与植物细胞分裂活性一致,如观察植物细胞愈伤组织的表达情况。④我们将进一步对报告系统的功能进行验证, 首先是对不同种类、不同浓度的细胞分裂素的响应情况,其次是报告系统对细胞分裂素

的响应是否具有特异性。再者是报告系统在转基因植物的自交后代中信号强度是否变化。

3. 研究的方法与方案

①载体的构建和植物转化

tcsn的启动子序列参照文献由人工合成序列。利用gus基因作为报告基因。可以利用中国杭州浙江大学实验室里的pdr5::gus载体。先利用sali和bamhi酶切开这两个酶切位点，把合成的tcsn的启动子装载到这个载体上。把装在好的载体转化到农杆菌（agrobacterium tumefaciens）菌株上。最后用该菌株侵染野生型水稻品种（shiokari）的愈伤组织。

②转基因阳性幼苗的筛选

4. 研究创新点

该课题的创新之处在于我们拟构建能够应用于单子叶植物的细胞分裂素报告系统。

5. 研究计划与进展

2019.3.1-3.15 课题成型阶段。完成开题报告，实验设计，培育野生水稻幼苗。进行水稻转导工作，培育转基因水稻幼苗

2019.3.15-5.1 主体实验阶段。依据实验方案逐步进行实验，收集数据，做好数据的收集汇总、初步处理工作

2019.5.1-5.31论文完成阶段。对已有数据进行处理，制作图表。重新审查课题决定是否进行实验补充，完成毕业论文