Crispr植物表达载体构建开题报告

全文总字数：2295字

1. 研究目的与意义

CRISPR/Cas技术作为一种近几年来最火热的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，受到众多科学家的青睐。

通过CRISPR载体构建的方法以及技术体系优化，通过基因敲除技术研究植物基因功能并且挖掘植物基因功能。

2. 国内外研究现状分析

CRISPR/Cas 系统主要分为三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型。目前，科学研究和报道最多的是II 型CRISPR/Cas 系统，即CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统已经成功在双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana) 、烟草(Nicotianabenthamiana) 、以及单子叶植物水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)等实现了定点基因组编辑。

CRISPR/Cas9 系统对双子叶植物基因的编辑研究首先选择了模式植物拟南芥，针对类胡萝卜素合成关键酶基因（AtPDS3）、抗病基因（AtFLS2）和活化态C 激酶1 受体（AtRACK1），分别设计sgRNA并在拟南芥的原生质体中进行瞬时表达，通过PCR 和测序比对的方法可知CRISPR/Cas9 系统对这3 个基因的编辑效率分别是5.6%、1.1%和2.5%2.7%。随后，在拟南芥中选择了几个功能缺失时有明显的生长表型的内源基因，油菜素内酯受体激酶基因（BRI1）、胁迫应答基因（JAZ1）和GA 应答基因（GAI）。经RFLP 分析检测和计算，BRI1 的突变频率为84.2%，GAI 的突变频率为47.1%，GAI 功能缺失的T1 拟南芥植株表现出矮小的表型，在JAZ1 的突变频率为81.7%。表明CRISPR/Cas9系统可以在模式植物拟南芥中进行高效的基因编辑。单子叶植物中水稻是重要的粮食产物，因此对水稻的研究具有重要的意义。Shan 等利用水稻偏好密码子优化Cas9 核酸酶基因，和水稻小核RNA 的U3 启动子和小麦U6 启动子转录sgRNA，定点敲除水稻PDS 和小麦MLO 等基因，在T0 代就获得纯合基因敲除水稻突变体，突变效率达到10%。面包小麦是异源六倍体，基因组十分庞大，大部分是高度重复序列，因此对基因组的改造难度相对比较大。Shan等(2013) 取小麦的原生质体为实验材料，针对小麦TaMLO基因，结果表明小麦原生质体突变效率在30%左右。Wang等(2014)设计了针对TaMLO-A1的sgMLO-A1，在72条T₀代转基因株系中发现4条独立的突变株系(5.6%)，与用TALEN技术获得的突变率差不多，他们在大量的突变株系中筛选3个TaMLO基因均发生突变的株系，增加了小麦对白粉病的抗性。CRISPR/Cas9能够同时对几个靶基因进行编辑，使得该技术在小麦等异源多倍体植物的基因功能研究方面，比其它技术更有明显的优势。玉米不仅是农学研究作物基因功能方面的重要模式植物，而且还是一种重要的粮食产物。玉米中的抗营养因子植酸，不能被人和动物消化，排泄到环境中会造成污染，所以有必要降低玉米中的植酸含量。Liang等(2014)针对玉米中植酸合成的关键酶基因ZmIPK构建了2个不同位点的CRISPR/Cas9载体，靶位点1和靶位点2，采用PEG介导的方法转化玉米原生质体，在暗培养48h后提取基因组DNA进行PCR-限制性酶切分析，靶位点1和2的突变频率分别为16.4%和19.1%，测序分析表明发生了不同程度的插入与缺失。这一研究说明CRISPR/Cas9在改良玉米品质方面可能起到重要作用。

3. 研究的基本内容与计划

通过crispr载体构建的方法以及技术体系优化，通过基因敲除技术研究植物基因功能并且挖掘植物基因功能。

2015/2/16-2016/3/1查阅文献， 了解常用的基因编辑手段及crispr技术的应用背景，掌握crispr载体作用原理，掌握crispr载体结构和构建原理。

2016/3/1-2016/ 4/1 杂交鹅掌楸wox1基因和wox5基因的crispr 载体构建。

4. 研究创新点

与传统的转基因技术相比，基因编辑技术具有能够准确地修饰基因组特定位点，减少对受体基因组信息损坏的优点。目前为止，基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFNs)、转录因子样效应物核酸酶(TALENs)和成簇的规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)这三类。与ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9技术具有操作简单，实验周期短，成本较低等优点。CRISPR/Cas9依靠RNA引导序列识别靶标DNA序列，在Cas9作用下首先引起目的DNA的双链断裂（double strand broken，DSB），然后通过主要通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）进行修复，其中gRNA为约20 个核苷酸的序列。目前，已在微生物和动物中得到广泛的应用，在植物中研究相对较少，尤其是木本植物。Zhou（2015）利用CRISPR/Cas9系统对杨树4CL基因进行了研究，实现了CRISPR/Cas9技术在木本植物中的应用。在此基础上，本实验计划构建杂交鹅掌楸WOX基因的CRISPR载体，实现CRISPR技术在杂交鹅掌楸中的应用。