蓝细菌光敏色素结构域AM1_1557GAF的分子克隆及体内重组研究开题报告

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1. 研究目的与意义

研究目的：得到一种基于生物合成的红外荧光蛋白。

研究意义：为进一步利用这种荧光物质在生物的体内的红外荧光标记奠定基础。

2. 国内外研究现状分析

荧光蛋白（fps）是研究生物医学的重要工具，在广泛应用中也经历着一次次的革新。20年以前，aequoreavictoria水母野生型绿色荧光蛋白（gfp）被标记在线虫的感觉神经细胞中；1999年，非生物发光暗珊瑚礁的红色荧光蛋白（rfp）被发现，并经不断改善和修饰，几乎能与野生型gfp媲美；shu.x等发现细菌中的光敏色素带有微弱的荧光，光敏色素应用于荧光探针的研究逐渐起步。藻胆色素蛋白等荧光发色团，因为水溶性、光稳定性，且能在活细胞中重组表达的优点，被较多地应用于免疫检测、荧光显微术等领域，是较好的生物化学示踪物。但仍存在明显的缺陷，因为需要特定的色素合成酶和藻胆蛋白裂合酶的催化作用。最近，蓝细菌光敏色素的研究有了新的进展，其单独的gaf结构域能自催化合成多种色素，并定向选择合成人们所需要的产物，提升当前色素蛋白作为荧光探针的应用潜力。

蓝细菌光敏色素多数包括n端和c端两个结构域两个部分，其n端结构域能够感受光信号，作为光感受区存在，包含胆素裂合酶结构域（bld）,有高度保守的gaf结构域，gaf结构域中存在藻胆色素生色团的结合部位。c端结构域则起着传递光信号的作用，将光信号转化为电信号或化学信号向下游传导。c端结构域由多个光信号调节结构域构成，如组胺酸激酶结构域（hamp）、类组胺酸激酶结构域（hkrd）、rec结构域等。

蓝细菌光敏色素的合成可以分为两个阶段，第一个阶段是藻胆色素的生物合成，第二个阶段是藻胆蛋白的生物合成（藻胆色素和蓝细菌光敏色素脱辅基蛋白的共价结合）。藻胆色素生色团是由4个相互连接的吡咯环组成的开链结构化合物，蓝细菌光敏色素中现已共发现2种藻胆色素生色团：藻蓝胆素（pcb）和藻紫胆素（pvb），两者是同分异构体。血红素经血红素氧化酶和胆绿素还原酶催化下作用转化为藻蓝胆素pcb。藻胆色素和蓝细菌光敏色素的gaf结构域脱辅基蛋白上保守性较高位点的半胱氨酸以硫醚键结合，形成蓝细菌光敏色素。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：

本研究的主要内容是在ncbi数据库中找到am1_1557基因序列，并获取其gaf序列，进一步在基因公司合成该序列，并插入到原核表达载体，与bv合成基因重组表达。在大肠杆菌中合成红外荧光蛋白bv-gaf，分析其光谱特征。

研究计划：

4. 研究创新点

近年来，有关光敏色素的研究已有一些进展，但其作为荧光标记物，存在明显的缺陷，因为需要特定的色素合成酶和藻胆蛋白裂合酶的催化作用。此次实验利用光敏色素单独的GAF结构域自催化合成多种色素，并定向选择合成人们所需要的红外荧光蛋白，提升当前色素蛋白作为荧光探针的应用潜力。