过量表达羧酸转运蛋白对重组大肠杆菌产丁二酸的影响开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

丁二酸是一种重要的c4平台化合物，广泛应用于食品、医药、农业领域，可用于合成1,4-丁二醇,四氢呋喃,γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(pbs)类生物可降解材料,被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。近年来，随着丁二酸新的应用领域的不断开拓，国际市场对于丁二酸的需求量猛增。传统的丁二酸生产方法主要为石化合成法，这种化学合成法生产丁二酸是以不可再生的战略资源石油作为原料，成本高，环境污染严重，对于石油依赖性强，无法实现可持续发展，严重阻碍了丁二酸的发展潜力。在石油资源日益枯竭的今天，发展环境友好的绿色生物技术已经成为一种趋势，因此，微生物发酵法生产丁二酸越来越引起人们的兴趣。利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖,木糖等）生产琥珀酸,原料来源广泛且价格低廉,污染小,环境友好,且在发酵过程中可吸收固定co2,能有效缓解温室效应,开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径。由此可见，开发高效的生物合成丁二酸的方法具有非常重要的社会和环境效益^[1-3]。

发酵菌株是琥珀酸生物合成的关键点之一,多数细菌和真菌都能产生琥珀酸,但是只有部分菌株可产生高浓度的琥珀酸,琥珀酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌^[4]。在众多的琥珀酸生产菌中，目前国内外的研究主要集中anaerobiospirillumsucciniciproducens，actinobacillussuccinogenes、mannheimiasucciniciproducens和重组escherichiacoli^[5]。朱蕾蕾等以富马酸钠为唯一碳源的选择性平板,从牛的瘤胃中分离得到一株琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenescgmcc1593，再通过ntg诱变，在50~100mmol/l的氟乙酸筛选平板上选出一株乙酸产量明显较出发菌株降低的氟乙酸抗性突变菌株sf-9，此菌株目前5l发酵罐一般琥珀酸发酵水平40~50g/l(最高60.2g/l),转化率0.7(w/w)左右(最高0.84),生产强度1.1~1.5g/lh(最高1.83g/lh)^[6] 。大肠杆菌具有培养条件简单,代谢网络明确,易改造,易操作等特点已成为生物法合成丁二酸的研究热点^[7]。

大肠杆菌现已知主要包含四个不同的c4-二羧酸二级运载体（dcua，dcub,dcuc和dcta）。dcta是负责在有氧情况下催化向胞内转运四碳二羧酸的载体^[8]。dcu运载体组成了一个著名的c4-二羧酸运载体，并且其运输模式和生理功能与dcta不同^[9-11]。dcua和dcub载体仅存在于进行延胡索酸呼吸的厌氧与兼性厌氧细菌中，他们组成了一类独立的蛋白家族。dcua和dcub是同源蛋白，其相似性为36%,dcua和dcub载体蛋白具有进行膜内外交换四碳二羧酸和向胞内转运四碳二羧酸的功能，并且具有由膜内向膜外运输四碳二羧酸的功能。根据dcua和dcub突变株的研究推测dcua和dcub的转运功能相似^[12]。dcub是富马酸呼吸中主要的c4-二羧酸运载体，并且有很高的富马酸-琥珀酸转换能力，它只在氧气和硝酸的缺失下和c4-二羧酸的存在下才能合成，dcua在有氧和厌氧条件下能够组成型表达，并且能替代dcub。dcuc表达的模式与dcua,dcub,dcta不同。zientz等发现dcua，dcub双突变体菌株仍然能在富马酸呼吸中大量生长，并且含有28%的富马酸-琥珀酸交换活性，由此发现了新的c4-二羧酸运载体dcuc^[13]。dcuc只在厌氧条件下合成，并且合成时不被或是只是被葡萄糖或硝酸轻微抑制，而且富马酸只有轻微的刺激作用^[8]。dcud是二级运载体dcuc家族的成员。在dcuc家族中，dcud是一个神秘的或弱表达的基因^[14]。uden等发现一个五突变菌株（dcua，dcub，dcuc，dcud，dcta，或citt)在合适的生长ph和有氧条件下仍能进行琥珀酸的运输，但是突变体中琥珀酸吸收的特性在ph值的依赖性，动力学参数，底物特异性和竞争性抑制上与野生型完全不一样，这说明突变体中一个未知的运载体替代了dcta^[15]。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

本课题通过PCR技术分别扩增EscherichiacoliK-12substr.MG1655菌株的dcuB和dcuC基因，所扩增的基因带有各自表达所用的启动子。然后分别将所扩增的目的基因与质粒连接，构建成重组质粒，并分别导入受体菌株构建成重组菌。最后与原始菌株做平行发酵试验。发酵结束后考察每组试验产丁二酸的产量，以此来探究羧酸转运蛋白DcuB，DcuC的过量表达对大肠杆菌产丁二酸的影响。