荧光素酶表达条件的优化开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1前言

荧光素酶是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(fireflyaldehyde)氧化发光的一类酶的总称。它源于自然界能够发光的生物的产能。根据来源，荧光素酶被分为萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase,FL)和细菌荧光素酶(bacterialluciferase,BL)。从不同地区的萤火虫提取的FL和从不同细菌中提取的BL分子量大小不同，FL的范围在60～64kD之间，BL的范围在77～79kD之间^[1]。荧火虫荧光素酶是由单一的多肽链组成，而且从不同种类的萤火虫提取的萤火虫荧光素酶的相对分子质量和结构皆不同。从北美萤火虫体内提取的荧光素酶相对分子质量约为6210³， 是由551个氨基酸残基构成的含有大量疏水氨基酸残基的单一多肽链，而从日本萤火虫体内提取的荧光素酶的相对分子质量约为6110³，含有548个氨基酸残基^[2]。研究发现细菌荧光素酶是由α、β2个多肽亚基组成的异源二聚体，其相对分子质量约为7910³。α亚基的相对分子质量约为4010³，β亚基的相对分子质量约为3710³。细菌荧光素酶反应的催化位点和底物结合位点都位于α亚基上，β亚基对这个活性结合是必需的，但β亚基的具体作用现在还未知^[2]。

2 荧光素酶的基本特性

2.1 荧光素酶结构

各种荧光素酶结构不同，但其差别不大，具有同源性。其中以北美萤火虫荧光素酶为例对其基本特征进行描述：北美萤火虫荧光素酶是由单一多肽链组成的，含551个氨基酸，不含辅助因子并且大部分氨基酸是非极性氨基酸，分子量约62kD，等电点是6.24，在空间结构中含有两对二硫键，并且有两个Trp，它的最大吸收值为562nm^[3]。具体蛋白结构见图 1-1：

图 1-1 荧光素酶的结构

在荧光素酶的三级结构中与生物发光相关的氨基酸残基分别是R218 R337 F247 S347 G315 G339 G341 K529 H245等，这些残基分别和相应的反应物结合进而催化发出黄绿色荧光。

和其它酶一样, BL活性受许多因素的影响:O2和离子浓度均能影响发光, H2O2、乙醛及长链烷基化合物在反应中刺激发光。从发光致病杆菌(X .luminescens)中提取的BL发现, 酶与FMN和豆蔻酸(十四烷酸)形成三元络合物, 三元络合物的慢分解限制了酶的转换, 脂肪酸能促进酶与FMN 的相互作用^[12] 。研究热稳定性发现,BL的热稳定性与其所表达的有机体有关, 但与有机体细胞的抗热性无关,木糖醇、甘油加入培养基中保护酶的活性^[13] 。N-乙基顺丁烯二酰亚胺对BL 失活的影响与pH 有关, 随缓冲溶液浓度的增大, 失活率升高。

2.2 荧光素酶的研究历史

1947年McElroy在研究萤火虫发光时发现了ATP是催化发光必不可少的成分。到了 1954年，Meclroy等从哈氏弧菌中提取并纯化出了荧光素酶。1967年，Friedland等对从费氏弧菌中提取出的细菌荧光素酶的结构和反应原理进行了分析。1956年，Green A等提取出萤火虫荧光素酶。在1970年，Denburg等第一次测定了萤火虫荧光素酶的结构。1985 年，DeWet 等首次克隆了北美萤火虫的荧光素酶基因，并在大肠杆菌中成功表达。1986 年，Marlene等第一个成功地获得了能够表达萤火虫荧光素酶基因的转基因烟草。同年 Jeffrey等构建了含虫光素酶基因的重组载体pkw101。Matuda 等也构建过含虫荧光素酶基因的重组体，并进而获得了能产生萤火虫荧光素酶的重组大肠杆菌菌株^[4]。

我国对荧光素酶的研究开展的相对较晚，从70年代开始才由中科院植物生理研究所的王维光等首次制备了萤火虫荧光素酶的粗提物，并用其测定了植物叶片光合作用时 ATP 的产量。1988年第二军医大学的陈克明、王英等从我国中华黄萤（Lucoila Chinesis）发光器中纯化出了荧光素酶，并与平学凡等人合成了虫荧光素。随着发光试剂和检测设备的不断更新，我国研究者对荧光素酶发光体系的研究及其应用也在不断的进步之中^[4]。

2.3 发光原理反应

荧光素酶以脂肪醛(RCHO)为底物,在还原型的黄素单核苷酸(FMNH2)及氧的参与下,使脂肪醛在氧化为脂肪酸的同时放出光子,产生490nm的荧光^[1]。FL在Mg2 、ATP、O2的参与下,催化D-荧光素(D-luciferin)氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550~580nm的荧光^[1]。

萤光生成反应通常分为以下两步^[5]：

萤光素 ATP → 萤光素化腺苷酸（luciferyl adenylate） PP_i

萤光素化腺苷酸 O₂→ 氧萤光素 AMP 光

3 检测方法

荧光素酶利用液闪仪或生物发光测定仪可以对荧光素酶的活性作出定量检测。因为在标准的反应条件下,加入超量的底物,在一定的时间间隔内荧光的闪烁总数与同样品中存在的荧光素酶的活性总量成正比^[6]。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测。

在正常条件下, 发光细菌在450～490nm时发出蓝绿色可见光.与被检物(如污水等)接触后, 当被检物中具有抑制发光细菌的物质达到一定浓度时, 则发光细菌的发光强度将发生改变, 其变化的程度与抑制物的毒性大小有关, 并与抑制物质的浓度在一定范围内相关.Alison M .Ho rsburg h 等^[7]利用基于发光细菌的生物传感器对水环境中的工业污染物进行了检测。

荧光素酶除了用发光仪测定外,还可以用闪烁计数器测定^[10，11],或将测定液放在X一光胶片及照相胶片下进行感光测定^[8],胶片感光测定的定量性比发光仪测定差,闪烁计数器测定的灵敏度与发光仪测定相同^[9]。

4 荧光素酶的应用

4.1病原微生物的快速检测方面

荧光素酶可用于测定样品中的ATP含量。荧光素酶在生物化学及生物技术的分析应用不断发展，其检测和研究范围包括：临床医学及法医学检测、生命科学研究、环境监测和酶联检测技术等^[4]。在荧光素酶催化发光反应的体系中，当荧光素和其他成分过量时，催化发光的强度于ATP的量会成正比关系。后来研究人员发现细菌ATP的含量是固定的，并且在活细胞中含量稳定。把细胞破碎后，细胞中的ATP完全释放出来，根据上述方法可以通过测量ATP的量间接估测细菌的数量。比传统的平板计数法更加优越^[14]。

4.2基因组序列的测定和分析技术中的应用

Nyren等人^[15]于1987年发展起来的一种新型的DNA测序技术：焦磷酸测序技术，其核心是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。我国学者宁勇等人^[16]在 2005 年建立了一种利用生物发光检测DNA聚合酶活性的方法。基本原理是：引物与模板 DNA 退火后，在四种酶的协同作用下，每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式记录模板DNA的核苷酸序列。

5 本课题研究的目的和意义

荧光素酶荧光素酶是酶性报告基因,可以利用其与特定目的基因的连锁或共转移,建立一种非放射性目的基因检测体系。由于现代检测仪器可以检测到10-19mol的荧光素酶,灵敏度很高,所以可以通过测定荧光素酶基因的表达,监测各种启动子(promotor)的活性^[1]。由于FL催化的发光反应中,ATP在一定的浓度范围内,其浓度与发光强度呈线形关系,因此。FL还可以快速灵敏测定ATP的浓度,应用于临床医学及法医学检测^[1]。此外,荧光素酶还可对环境和食品中有毒有害物质(如大肠杆菌等)进行分析。以荧光素酶应用在病原微生物的快速检测方面为例来说，目前此装置已经应用于各大医院，宾馆及食品药品监督部门并以较快的速度进入家庭生活中。在其他方面，荧光素酶也以惊人的速度发展^[4]。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1.研究的问题：

atp是所有生命活动的能量来源，在微生物体系，其与微生物的数量成一定的线性关系。荧光素酶可以催化atp产生荧光，从而根据所检测到的荧光强度可以大致确认体系微生物的数量。因此近年来荧光素酶被广泛应用于食品微生物污染的快速检测。而目前市面上所售的荧光素酶稳定性不高、酶活性极易降低，酶的保存、运输都是在冷冻条件下进行，在使用过程中要在冰上完成，且不能反复冻融多次，难以满足现场检测的需求。

前期研究过程中已获得了一株具有一定稳定性的荧光素酶生产菌，本研究拟就其表达工艺进行优化，为荧光素酶的批量生产提供指导。