解脂耶氏酵母发酵产油脂过程优化的研究开题报告

1．结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写

2000字左右的文献综述：

文 献 综 述

引言

解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica ) 是非常规酵母中具代表性的一种, 它底物广泛, 尤其能利用有机酸( 柠檬酸、异柠檬酸) , 蛋白类( 蛋白酶、脂肪酸、酯酶、磷酸酶、α - 甘露糖苷酶、R N a s e ) 。 烷烃类廉价物质作为底物分泌大量的代谢产物, 自上世纪 40年代被发现以来, 越来越受到研究者的重视, 并于上世纪 90年代被开发成为一种新的酵母表达系统, 用于 42种异源蛋白的高效表达。 综述了解脂耶氏酵母表达系统及其特点, 有利于研究者从转录和翻译的水平研究异源蛋白在此菌中的表达分泌路径以及寻找到调控型启动子。[1]

解脂耶氏酵母于 1942年首次被分离得到, 先后被命名为 Candida lipolytica、 Endomycopsis lipolytica、Sacharomycopsis lipolytica，最终定名为 Yarrowia lipolytica (解脂耶氏酵母)。解脂耶氏酵母是非常规酵母中的一种。所谓非常规酵母是除了酿酒酵母和粟酒裂殖酵母之外的所有酵母的总称, 包括: 毕赤酵母 、 乳酸克鲁维酵母 、解脂耶氏酵母等。[2]

解脂耶氏酵母的优点[ 3]在于 : 1) 解脂耶氏酵母被认为是安全的 (generaly regarded as safe ) , 因此 , 能用于食品和药物生产上 ; 2) 它能大量分泌多种代谢产物, 自上世纪 60年代就开始用于食品 、S C P (single-cell protein) 等的工业化生产 ; 3) 它能利用很多普通的碳水化合物和脂肪作为碳源 , 这也使得它更适合于不同的工业应用 ; 4) 它是非常规酵母中离酿酒酵。

植物、动物及微生物所含油脂，多为新陈代谢产物。植物的油脂主要分布在种子中，含量约 50%。动物油脂可分为陆生动物油脂和海生动物油脂，陆生动物油脂多为固态，主要集中于脂肪组织和内脏；海生动物油脂为液态，多分布在皮下，而鱼类油脂主要存在于肝及其他内脏中；微生物油脂作为一种新型油脂近年来也逐渐引起人们关注。油脂在日常生活中具有重要意义，其被广泛应用于食品工业、医药工业等领域，如食用动、植物油，医用的软膏、栓剂等，有些油脂还有特殊的药理作用，如大风子油治疗麻风病、鱼肝油治疗维生素 A、维生素 D 缺乏症等。因此，研究油脂提取相关工艺技术及方法具有重要的应用价值。现综述近年国内外油脂提取技术和方法进行分类介绍，并对发展趋势进行了分析。[4]

解脂耶氏酵母的分子生物学特性

解脂耶氏酵母在分子生物学方面与其他酵母相比 差异 较大[ 5]。它 的基 因组 G -C含量 较高( 49. 6% ～ 51. 7%) ,且 r D N A 结构较其它酵母特殊 ,没有 R N A 聚合酶 Ⅰ序列 , s n RNA和 7s RNA 大小与高等真核生物的较接近, 而与 S . cerevisiae, K . lactis, C. albicans 氨基酸同源性只有 50% ～ 60%。由于R N A 聚合酶Ⅱ启动子和转录因子与 S . cerevisiae 的差异较大, 故解脂耶氏酵母的基因几乎不能在 S . cerevisiae 中进行表达 。有约 13%的基因含有内含子 ,密码子偏爱性不同于酿酒酵母, 而类似于曲霉菌。

随着石油资源的日益紧缺、 石油价格的不断上涨, 油品供需矛盾的日渐显现及环境污染问题的日益突出, 多渠道开发生物油脂资源成为必然[6]。目前油脂的原料主要是植物、 动物和微生物[7 8]。微生物油脂与动植物油脂相比具有以下优点: 细胞增殖快, 生产周期短; 生长所需的原料来源广泛,价格便宜, 还可利用食品工业和造纸行业的废弃物等, 有利于保护环境; 所需劳动力少, 不受季节、 气候变化的限制; 能连续大规模生产, 生产成本低;可利用细胞融合、 诱变等技术, 使微生物生产出比动植物油脂更符合人们需要的高营养油脂或含某些特定脂肪酸的油脂。所以这种新型油脂备受关注, 具有广阔的发展前景。

响应面方法

响应面方法是利用合理的试验设计并通过对实验数据进行一定的处理,建立影响因素与响应值之间的函数关系, 得到一个回归方程, 通过对回归方程进行分析 ,选择最优工艺参数. 这种方法已广泛应用于粮油食品 、 化学化工等方面的工艺配方设计及加工工艺条件的优化 . 本文就响应面方法的优点 、 试验设计的方法以及实验数据的处理进行了简单的阐述 ,对其应用的限制因素进行一一说明 ,并就具体应用列举了一个简单的实例。[9] RSM 是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据, 采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系, 通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数 ,解决多变量问题的一种统计方法[ 10]. 随着计算机的发展 ,它已成为精度高、 应用广并具有实用价值的优化技术 . 响应值和变量之间的关系可以形象地用响应面表示出来,它可用在以下 3 个方面: ①描述单个试验变量对响应值的影响 ; ② 确定试验变量之间的相关关系;③ 描述所有试验变量对响应值的综合影响.

RSM 的 4 个步骤

( 1) 确定因素 : 就是确定要考察的过程中的关键因素 ,即研究范围内主要影响加工过程和产品质量的重要因素. 当然假设实验者已经知道这些因素是什么. 如果预先不知道 ,可以通过一些基本的实验来确定这些因素. 为了简单起见, 用 RSM来研究的因素一般为两到三个; 当然 RSM 也可以研究多变量问题 ,但其结果比较复杂.

( 2)确定因素水平: 通过做单因素试验或由样品的特性和工艺来确定因素水平的范围.如果这些水平的范围太宽 , 无法给出精确的优化条件, 可以再做一个因素水平范围较小的 RSM 以求得到更为精确的优化条件和回归方程 . 当然对于一些样品, 它的因素水平都由物料性质、 成本限制和相应标准严格限定 , 这时最优值可能在实验的因素水平之外, 在这种情况下实验者无法给出特定的优化条件 , 需要根据具体情况进行分析[ 11].

( 3) 确定实验点: 采用适当的试验设计, 确定实验的试验点. 试验设计强调试验点要尽量减少总的实验次数. 试验点确定之后,按随机性原则对每个实验点进行实验 ,获得一定的数据 ,以便于进行统计分析.

( 4) 数据分析 : 用适当的统计分析方法和计算机程序,对实验数据进行分析 . 这些分析结果最好由统计学家 、 产品开发者和其它相关的科研人员共同协作来加以解释 , 由分析得来的结果将用于下一步的过程优化. 常有的统计分析软件有 SAS、SPSS 等 ,国内也有很多研究机构开发出了自己的统计分析软件. 值得注意的是 ,对于任何研究的结果,都不能对研究范围之外的情形进行外推.

响应面方法的应用

由于 RSM 能考虑多个因素在不同水平下对产品的影响,因此 RSM 在产品的开发和研究中有各种各样的应用. 例如 RSM 在酶水解的研究中主要有以下 3 方面的作用:

( 1) 在给定的范围内确定因素的最佳组合 ,并给出在最佳组合处的响应值;

( 2) 确定响应值随因素的变化情况;

( 3) 确定同时满足因素水平要求的响应值 .在复合风味蛋白酶( Flavorzyme) 的水解条件

研究中[12],影响水解度的因素主要有: 酶水解体系的温度、 pH 值、E/S( W/W) . 依据产品的说明及要求,分别选取温度: 50℃、 55℃、 60℃,pH 值 : 5. 0、 6. 0、7. 0 和 E/S: 65、 70、75( LAPU/克底物) . ,然后对每一个实验点进行试验, 测得水解度( DH) 的数据. 运用 SAS 软件进行 RSREG[13]过程分析 , 得出回归方程 ,并对回归方程进行一系列的检验 . 为了进一步的讨论 ,作响应面图和等值线图 ,图 1 为响应面图, 图 2 为等值线图. 等值线图中的曲线表明, 随着响应值的增加而形成一个顶点或小山,26. 3( % ) 是这些点中的最大值, 这个最大值对应的各坐标轴的值为温度 55. 5℃、pH6. 2、E/S74. 3LAPU/克底物. 从响应面图上可以清楚地看出水解度最大值.

RSM 是一种有效的统计技术, 它是利用实验数据, 通过建立数学模型来解决受多种因素影响的最优组合问题 . 通过对 RSM 的研究表明, 研究工作者和产品生产者可以在更广泛的范围内考虑因素的组合,以及对响应值的预测 ,而均比一次次的单因素分析方法更有效 .RSM 有许多方面的优点, 但它仍有一定的局限性 . 首先, 如果你将因素水平选的太宽, 或选的关键因素不全 ,将会导致响应面出现吊兜和鞍点,因此事先必须进行调研, 查询和充分的论证; 其次,通过回归分析得到的结果只能对该类实验作估计 ; 第三, 当回归数据用于预测时 ,只能在因素所限的范围内进行预测. 即使如此, RSM 仍不失为一种研究多因素问题强有力工具, 希望通过介绍 RSM 技术, 能帮助更多的研究工作者利用 RSM

技术, 方便有效地解决工作中的设计与数据处理问题 .

发酵工艺

补料发酵工艺

补料发酵( Fed-batch Fermentation) 就是指在分批发酵过程中, 间歇或连续地补加含有限制性营养成分的新鲜培养基。有如下优点：有利于菌体的高密度培养；降低培养基中有毒底物对菌体生长的抑制；解除高浓度营养物和分解代谢物引起的阻遏作用；维持有利的发酵条件^[14]。补料的控制分为反馈控制补料和无反馈控制补料。其中反馈控制补料分为简单反馈控制( 又称单一循环法)补料、根据营养物摄取或需求量来控制补料、根据比生长速率来控制补料、根据尾气成分分析来控制补料、根据细胞形态学控制补料、模糊控制的补料。无反馈控制又分为恒速补料、变速补料、指数补料。Ileana-Maria Jurchescu^[15]等人采用补料发酵，2,3-丁二醇的最终浓度可达144.7g/L，产量可达1.14 g/(L h)。Thomas^[16]等人通过对Paenibacillus polymyxa DSM 365菌株进行补料发酵。

1.1 碳氮源

碳氮比，是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比叫做碳氮比。一般用C/N表示。如蘑菇培养料的碳氮比为30－33：1，香菇培养料的碳氮比为64：1。适当的碳氮比例，有助于微生物发酵分解。

1.2 温度的影响

生物反应的效率严格依赖于温度的主要原因是酶活性和细胞的生长都强烈地依赖于温度。不同细菌产生2,3-丁二醇的最适温度通常在30～39℃，而细菌生长的最适温度一般为24℃，因此发酵的温度也需要特别注意^[17]。

1.3 pH的影响

pH 在调节细菌的代谢过程中起着重要的作用,尤其是在含有大量复合产物的发酵过程中， pH 对发酵结果的影响尤为明显。2,3-丁二醇发酵过程中含有相当多的副产物， 如3- 羟基丁酮、乙醇、乙酸、乳酸等。2,3-丁二醇生成路线以及这些副产物生成路线的相关酶最适pH 并不一致, 因而发酵过程中pH不仅会影响细菌的生长, 还会影响细菌的代谢过程。一般, 碱性条件有利于有机酸的生成，此时2,3-丁二醇的产量较低; 而在酸性条件下，有机酸的产量则下降至碱性条件下的1/10，产物中的主要成分为2,3-丁二醇^[18]。

1.4 溶氧的影响

溶氧是显著影响2,3-丁二醇生物合成水平的关键参数之一，主要表现为溶氧对代谢途径各个支路的分配调控作用。过高的溶氧浓度虽有利于菌株的生长，2,3-丁二醇的生物合成水平却不高^[19]；而当供氧限制时，会导致系列副产物的产生^[20]。此外，通气量不仅会影响2,3-丁二醇的产量，还会影响某些菌株终产物中2,3-丁二醇的光学活性。Nakashimada 等^[21] 在培养P. polymyxa时发现,增加氧气的供给量会降低产物中混旋型2,3-丁二醇( meso- )的比例，从而显著增加D型2, 3-丁二醇的比例。因此，发酵过程中2,3-丁二醇的得率可以通过控制氧气供给量来调控。发酵过程中菌体细胞可利用的氧气量取决于发酵液的DO水平，而DO水平可以通过气相中的氧气分压( 氧气比例) 调节，因此氧气分压可作为控制发酵过程的参数。

参考文献

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