藏红花素类物质生物合成途径中关键酶PDS、ZCO、UGT基因的生物信息学分析开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

一 藏红花

藏红花，原名番红花，又称西红花，原产地在希腊、小亚细亚、波斯等地，番红花是经印度传入西藏，由西藏再传入中国内地。所以，人们把由西藏运往内地的番红花，误认为西藏所产，称做藏红花。

藏红花具有较高的药用价值。现代药理研究证明它对改善心肌供血供氧等方面疗效确切，藏红花中含有多种甙的成分，多种甙可明显增加大冠状动脉的血流量^[1]。

科学家发现藏红花的花蕊中含有的藏红花酸（Crocitin）、藏红花(safranal)、藏红花素(Crocin)和藏红花苦素(Protocrocin)等都具有较强的抗癌活性^[2-3]。其抗癌机制是抑制癌细胞的DNA和RNA合成，抑制细胞蛋白激酶的活性和原癌基因的表达，抑制苯并芘和12-O-14酰基磷酮-13乙酸盐（TPA）等致癌物质的毒性，从分子水平抑制肿瘤的形成。其癌细胞的半致死量为0.8～2muM，毒性远远小于维甲酸^[4]。因此，藏红花素等抗癌活性物质将成为21世纪最理想的抗癌药物之一。

二 藏红花素的合成途径及相关酶

藏红花素类物质生物合成途径^[5-6]主要分为三个阶段：第一阶段是类异戊二烯前体途径；第二阶段是类异戊二烯形成类胡萝卜素途径；第三阶段是藏红花酸在糖基转移酶作用下糖酯化形成藏红花素类物质阶段。

第一阶段异戊二烯的生物合成存在两条途径:一条途径是甲羟戊酸途径（MVA），在细胞质中进行，以乙酰CoA为前体；另一条途径是丙酮酸/磷酸甘油醛途径（MEP），又称为非依赖甲羟戊酸途径，主要在质体中进行，以3-磷酸甘油醛和丙酮酸为前体。

MVA途径起始于乙酰辅酶A，在乙酰乙酰CoA硫解酶(ATOT)作用下形成乙酰乙酰CoA，经羟甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)催化形成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)，在羟甲基戊二酰C0A还原酶(HMGR)合成甲羟戊酸（MVA），之后MVA在甲羟戊酸激酶(MK)的作用下，形成甲羟戊酸-5-磷酸(MVAP)，接着在磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)作用下生成甲羟戊酸-5-焦磷酸(MVAPP)，最终在5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MPD)作用下生成异戊烯基焦磷酸（IPP）。

MEP途径首先由1- 脱氧木酮糖-5- 磷酸合酶（DXS）催化3-磷酸甘油醛（GA-3-P）和丙酮酸（Pyruvate）缩合形成1-脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP），再由1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）催化生成2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP），MEP 经4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤藓醇合酶（CMS）环化作用下生成4-二磷酸胞苷-2-甲基赤藓醇（CDP-ME），之后在4-二磷酸胞苷-2-甲基赤藓糖激酶（CMK）作用下生成 4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸（CDP-ME2P），在 2-甲基赤藓糖-2,4-环二磷酸合酶（MCS） 作用下生成 2-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸（ME-4CPP），在 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶（HDS）作用下形成 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸（HMBPP），最后1-羟基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶（HDR）催化形成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。

第二阶段：以上两种途径中IPP自身不能离子化, 需要 IPP 异构酶和二价金属离子将其转化为具有活性的异构体DMAPP。在牻牛儿基焦磷酸合酶（GPS）的催化下，IPP 和 DMAPP 以头对尾或头对头相接的方式缩合成牻牛儿基焦磷酸（GPP），GPP 再与IPP 经呢基焦磷酸合酶（FPS）催化，缩合成法呢基焦磷酸（FPP），FPP再与IPP 经牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPS）催化，形成牻牛儿牻牛儿基焦磷酸（GGPP）。2分子GGPP 在八氢番茄红素合成酶（PSY）催化下缩合形成八氢番茄红素，在八氢番茄红素脱饱和酶（PDS）催化下，八氢番茄红素脱氢生成六氢番茄红素，进一步脱氢生成ζ-胡萝卜素。在ζ-胡萝卜素脱饱和酶（ZDS）催化下，ζ-胡萝卜素脱氢生成链孢红素，进一步脱氢生成番茄红素。番茄红素是类胡萝卜素进一步合成代谢的分枝点。在β，ε分枝，番茄红素在番茄红素ε-环化酶（LYCE）催化下生成δ-胡萝卜素，在经番茄红素β-环化酶（LYCB）催化下生成α-胡萝卜素。α-胡萝卜素在ε-胡萝卜素羟化酶（ECH）的作用下羟化，转变成新黄质。在在β，β分枝，番茄红素在LYCB催化下先转化成γ-胡萝卜素，继而生成β-胡萝卜素。β-胡萝卜素在β-胡萝卜素羟化酶（BCH）的作用下羟化，转变成玉米黄质。玉米黄质在玉米黄质裂解酶（ZCD）的催化下形成藏红花苦素和二甲醛藏红花酸。藏红花苦素进一步降解氧化形成臧红花醛。二甲醛藏红花酸被氧化成藏红花酸。

第三阶段：藏红花酸在糖基转移酶（UDPG）的催化下形成藏红花素。

三 电子克隆

电子克隆是利用计算机技术，依托现有的网络资源( EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等)，采用生物信息学方法( 包括同源性检索、聚类、序列拼装等)，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR 快速地获得部分乃至全长cDNA序列的方法^[7]。

首先，在数据库或PubMed 中获得感兴趣的cDNA 或氨基酸序列，基于EST 和基因组信息两种数据资源，利用上述得到的已知基因序列实施电子克隆有以下两种方案。

利用EST 数据库信息资料: ①利用序列同源性比较软件(如Blast软件) 将种子序列对库检索；②从数据库中挑选出全部相关序列；③对所有序列进行片段整合分析( 即Contig分析)，形成延伸后的序列，称新生序列。随后，将此新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能被进一步延伸为止，通过完整性分析即获得了

全长的新基因序列^[8-9]。

利用基因组信息资料: 把作为信息探针的氨基酸或核苷酸序列在NCBI网站中对特定物种各基因组数据库进行BLAST分析，从结果中筛选出感兴趣的外显子序列，并通过链接得到其所在的基因组序列，同时根据比对的结果对基因组序列可能造成的移码测序错误进行修正；把这些感兴趣的外显子序列按照其所在基因组上的位置依次进行直接连接，或者把基因组序列提交到GenScan和GeneFinder 等网站进行预测，得到可能的新基因序列^[10-11]。有时各外显子分别处于较短的尚未组装的基因组序列中，也可按探针基因外显子顺序进行直接拼接; 把可能的新基因序列基于核酸数据库做BLAST分析，检验其新颖性; 把筛选后的新基因序列提交到dbEST数据库做BLAST分析并延伸，同时也是进一步确认其真实存在的可信度，并进行组织表达定位，为克隆该基因提供组织来源信息。最后根据最终的序列设计引物，进行RT-PCR实验得到新基因^[12]。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1. 研究的问题

随着EST数据库的进一步完善，电子克隆策略已成为克隆新基因的重要方法，并成功地应用于人类基因组的研究。利用EST资料的电子克隆是克隆功能基因的新途径。本课题通过电子克隆的方法克隆藏红花素生物合成相关酶基因的全长基因并采用生物信息工具对其性质包括氨基酸序列组成，疏水性或亲水性，二级和三级结构等特点进行了探讨。

2. 研究的途径

（1）选择与藏红花生物合成相关的酶具有较高亲缘性的酶基因作为查询探针，搜索藏红花的表达序列标签（EST）数据库，将得到的EST序列进行在线拼接，得到EST重叠群，将拼接后的较长序列再作为探针重复上一步的Blastn，直到拼接序列无法延伸为止，获得藏红花素生物合成相关酶基因的全长的基因编码序列。

（2）采用生物信息工具对所获得的酶基因的全长编码序列的性质包括氨基酸序列组成，疏水性或亲水性，二级和三级结构等特点进行了探讨。