筛选耐酸性产琥珀酸放线杆菌开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1 概述

1.1琥珀酸的性质

琥珀酸，学名丁二酸，分子式为C₄H₆O₄，分子量118.09，结构式为HOOC(CH₂)₂COOH。无色结晶体，味酸，可燃。熔点188℃，沸点235℃，相对密度1.572 g/cm³(25℃)，溶于水、微溶于醇、醚、酮类，几乎不溶于二硫化碳、苯、四氯化碳，不溶于氯仿、二氯化碳。^[1,2]琥珀酸作为一种二元羧酸，加热到134.8℃时两个羧基可脱水生成丁二酸酐，分子式为C₄H₄O₃。25℃时水溶液中琥珀酸可以解离为丁二酸根阴离子和质子，解离常数分别为K₁=6.52～6.6510^-5，K₂=2.2～2.710^-8，0.1 mol/L水溶液的pH为2.7。

1.2琥珀酸的应用

琥珀酸是一种广泛存在于各种生物中的有机酸，是生产多种化学产品的中间原料，作为一种重要的C₄平台化合物，琥珀酸及其衍生物在食品、医药、农业、化工等领域中有重要用途，主要有以下四个市场：最大的市场是作为表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂；第二是离子鳌合剂；第三个市场是食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂；第四个市场是和健康有关的产品，包括医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产，市场总量每年超过四亿美元^[3]。但琥珀酸真正的潜力是作为大规模工业原料的应用，替代苯和石油等大宗化工原料，其中以琥珀酸为前体的C₄大宗化学品1,4-丁二醇、四氢呋喃、g-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮等的市场需求超过200亿元/年。制备新型可完全生物降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）也将成为琥珀酸的重要应用领域^{[4, 5]}。图1-1是以琥珀酸为基础的化学制品。

最新的研究结果还表明琥珀酸将在生物降解塑料的制备应用方面具有非常广阔的前景^[6]。将琥珀酸与1, 4-丁二醇进行聚合反应可生成一类新型的生物降解塑料产品聚丁二酸丁二醇酯（PBS）^[7]。传统的脂肪族聚脂熔点较低因而不能单独用作塑料，PBS具有良好的热稳定性，并且其高分子量产品易得，又较同类的聚草酸酯具有优越的特性，因此在新一类生物降解塑料中备受青睐。琥珀酸在生物降解塑料上的应用将成为今后其

市场需求的一个新的激增点。

图1-1 以琥珀酸为基础的化学制品路线图

1.3 琥珀酸的制备方法

1.3.1生产方法的介绍

（1）化学合成法

当前大部分的丁二酸都是通过化学法生产的，其中在工业生产上应用的方法主要有催化加氢法、石蜡氧化法、电化学合成法。将这三种方法总结如表1-1所示：

表1-1 化学法合成丁二酸的方法比较

（2）微生物发酵法

近年来发酵法生产丁二酸成为有机酸发酵研究的热门课题，以可再生的生物质能源玉米、木薯等基本原料预处理后得到糖液作为碳源，经微生物菌种厌氧发酵同时固定CO₂，发酵液再经过分离提取等步骤得到纯的丁二酸结晶产品。其中微生物发酵法生产丁二酸的主要工艺流程如图1-2所示。

图1-2 发酵法生产琥珀酸的主要工艺流程

1.3.2 合成方法的比较

传统的化学法生产丁二酸成本高、污染大且依赖于石化资源，严重抑制了丁二酸作为大宗化学品的潜力，与化学合成法相比微生物发酵法生产丁二酸有诸多优点。

首先，发酵法的原料主要来自可再生资源如玉米、乳清等，它不仅能提供菌体生长所必须的碳水化合物而且能够提供廉价的氮源。这也将消除很大的环境污染，而且实现了资源的循环利用。

其次，上述微生物发酵生产工艺若再配以回收新工艺，预计丁二酸的成本比传统的化学生产法成本将大幅度降低，这就使发酵法生产的丁二酸为大量生产化学制品提供可能，它可以作为很多重要的中间产物和专业化学制品。作为一种商品化的化学制品，因为丁二酸的环境友好特性，成本的降低会有利于该产品取代很多基于苯和石化中间产物的商品，这可减少在超过250种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，并节约大量的能源，大大缓解现今社会的能源大量短缺的现象，减少煤等不可再生资源的消耗，社会和环境效益显著。

第三，由于发酵法生产丁二酸是以可再生糖源（如葡萄糖）和CO₂作为主要原料，因此新工艺本身不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且还开辟了温室气体CO₂利用的新途径。如果可以将丁二酸发酵和乙醇发酵过程整合在一起，不仅可以解决乙醇发酵的空气污染问题，同时也可以降低生产这两种有机物的成本^[8]。

1.3.3 基因工程大肠杆菌

　基因组重组技术是在20世纪90年代由美国加州Maxgen公司在原生质体融合技术的基础上提出了一个概念，是经典微生物诱变育种技术与原生质体融合技术的有机结合。自此技术诞生以来，短短几年时间里在工业生产菌种改进及开发方面就获得了成功的应用。2002年，Zhang等^[9]成功应用基因组重排技术快速提高了弗氏链霉菌的泰洛星产量。同年，Patnaik等^[10]也通过基因组重排技术提高了乳酸杆菌的耐酸性能。因此，我们期望通过基因组重组技术来提高菌株耐酸性是可能的。选育耐酸性琥珀酸放线杆菌，可以减少发酵过程中pH中和剂的使用，有效地减少杂菌污染，简化产品后处理工艺，降低生产成本，对发酵法生产琥珀酸的工业应用具有重大意义。

原生质体的制备和再生是基因组重组技术中非常重要的两个环节。现关于产琥珀酸放线杆菌高产菌株选育的报道较多，但通过基因组重组技术对产琥珀酸放线杆菌进行菌种选育的报道还很少。

1.3.3.1原生质体的制备

将菌液37℃在TSB培养基中培养到对数生长期，6000r/min离心5min，弃上清，将菌体重悬于适量SMM中，使菌液OD₆₆₀=1.0，取部分菌液，梯度稀释后涂布完全平板计算菌数为A，另一部分菌液中加入溶菌酶溶液，混匀，恒温酶解，在酶解30min，45min，60min时分别取样，电镜观察酶解情况。

1.3.3.2原生质体的再生

将酶解后的菌液一部分用无菌水梯度稀释后涂布完全平板，计算菌数为B，另一部分用高渗稳定液SMM梯度稀释涂布高渗平板，计数为C。原生质体的制备率和再生率的计算方法如下式^[11]：

原生质体的制备率＝（A-B）/A100%

原生质体的再生率＝（C-B）/(A-B)100%

2 琥珀酸生产菌株的筛选

2.1 常压室温等离子体诱变技术

常压室温等离子体（Atmosphere and Room Temperature Plasma，简称ARTP）是近几年来发展起来的一种等离子体源，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流。可续研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，今儿使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。

采用氦气为工作气体的常压室温等离子体源中含有多种化学活性成分，如OH（A2 ，=0→X2=0,306-310nm）、氮分子二正系统（C3u-B3g）、氮分子一负系统（B2u-X2g）、激发态氮原子、氢原子和氧原子等。常压室温等离子体中的化学活性粒子成分能够使DNA等遗传物质的分子结构发生改变。该技术特点为：无需抽真空、无需高压电源、低温等离子体、等离子体射流更均匀、制备多样性突变库。

2.2 原生质体融合法选育

　 将琥珀酸放线杆菌CGMCC2650的原生质体再生后得到的菌株在加有琥珀酸的耐酸性平板（分别为pH5.6，pH5.5，pH5.4，pH5.3）上培养，筛选出能耐受相应pH值的突变菌株^[11]。

2.3 恒化器选育

恒化器选育是以一定的选择性压力为手段，利用菌体对环境的自适应机制，从细胞库中筛选出所需要的表型突变，使菌体选择性进化的方法^[12]。进化代谢是一种非常高效的菌株筛选方法，它在生物进化研究和菌株选育中具有广泛的应用。利用基因组学与进化代谢技术相结合的方法，可以直观地了解到变异菌体整个基因组的变化，在菌体适应性进化的动力学和基因学基础方面也获得了巨大的成功^[13-14]，这对于研究生物进化是一种里程碑式的突破。因为细菌具有数量大，传代速度快，并且可以适应一定环境的优点，因此对于可以适应选择性压力的菌体，能够快速地适应外界环境并达到稳定的生长状态，从而在进化代谢的过程中获得生长优势，对于那些不能快速适应环境的菌体，由于其生长速度慢，则很快被优势菌体淘汰^{[13, 15-16]}。进化代谢方法主要用于以下几个方面的菌株选育，一是选择能够抵抗某种底物或产物压力的高抗逆菌株，如改善产琥珀酸放线杆菌在琥珀酸生产中铵根离子的抑制^[17-18]，二是选择可以高效利用某些底物的菌株，如改善菌体对某些糖的利用效率^[19-23]。三是选育可以高效生产某一特定产物的菌体^[24-25]。

【参考文献】

[1] 司杭. 化工产品手册[M]. 北京：化学工业出版社，1985.

[2] 凌关庭. 食品添加剂手册[M]. 北京：化学工业出版社，1991.

[3]Zeikus J G, Jain M K, Elankovan P. Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 51(5): 545-552.

[4] Morris D, Ahmed I. Rural development: biorefineries and the carbohydrate economy[M]. USA: Institute For Local Self-Reliance, 1993.

[5] 郭宝华，丁慧鸽，徐晓琳，等.生物可降解共聚物聚丁二酸/对苯二甲酸丁二醇酯(PBST)的序列结构及结晶性研究[J].高等学校化学学报，2003,24(12):2312-2316.

[6]Tokiwa Y, Caiabia BP. Biological production of functionalchemicals from renewable resources. Can J Chem, 2008,86(6): 548555.

[7] Lee S Y, Hong S H, Lee S H, et al. Fermentative production of chemicals that can be used for polymer synthesis [J]. Macromolecular Bioscience, 2004, 4(3): 157-164.

[8] Lee W G., Lee J S, Shin C S. Ethanol production using concentrated oak wood hydrolysates and methods to detoxify[J]. Appl Microbiol Biotechnol. 1999, 77-79: 547-559.

[9]ZhangYX，KimP，VinciVA，etalGenome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria.Nature，2002，415：644-646

[10] Patnaik R，LouieS,GavrilovicV,etal.Genomeshuffling of Lactobacillus for improved acid to lerance.Natbiotechnol,2002,20:707-712

[11] 毛雨，王丹，李强，邢建民，黄占斌 产琥珀酸放线杆菌的原生质体制备与再生 中国生物工程杂志 2010.11.30

[12] Lee JW, Kim TY, Jang YS, et al. Systems metabolic engineering for chemicals and materials. Trends Biotechnol, 2011, 29(8): 370378.

[13] Portnoy VA, Bezdan D, Zengler K. Adaptive laboratory evolutionharnessing the power of biology for metabolic engineering. Curr Opin Biotechnol, 2011, 22(4): 590594.

[14] Conrad TM, Lewis NE, Palsson B. Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol Syst Biol, 2011, 7(509): 111.

[15] Charusanti P, Fong NL, Nagarajan H, et al. Exploiting adaptive laboratory evolution of Streptomyces clavuligerus for antibiotic discovery and overproduction. PloS ONE, 2012, 7(3): e33727.

[16] Unrean P, Srienc F. Metabolic networks evolve towards states of maximum entropy production. Metab Eng, 2011, 13(6): 666-673.

[17] Ye GZ, Li J, Xi YL, et al. Isolation of NH4 -tolerant mutants of Actinobacillus succinogenes for succinic acid production by continuous selection. J Microbiol Biotechnol, 2010, 20(8): 12191225.

[18] akar ZP, Turanl-Yildiz B, Alkm C, et al. Evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved industrially important properties. FEMS Yeast Res, 2012, 12(2): 171182.

[19] Jiang L, Li S, Hu Y, et al. Adaptive evolution for fast growth on glucose and the effects on the regulation of glucose transport system in Clostridium tyrobutyricum. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(3): 708-718.

[20] Jantama K, Haupt MJ, Svoronos SA, et al. Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C that produce succinate and malate. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(5): 11401153.

[21] Chen K, Iverson AG, Garza EA, et al. Metabolic evolution of non-transgenic Escherichia coli SZ420 for enhanced homoethanol fermentation from xylose. Biotechnol Lett, 2010, 32(1): 8796.

[22] Cadire A, Ortiz-Julien A, C Camarasa, et al. Evolutionary engineered Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains with increased in vivo flux through the pentose phosphate pathway. Metab Eng, 2011, 13(3): 263271.

[23] Cai Z, Zhang B, Li Y. Engineering Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: reflections and perspectives. Biotechnol J, 2012, 7(1): 3446.

[24] Zhang X, Jantama K, Moore JC, et al. Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(48): 2018020185.

[25] Hong KK, Vongsangnak W, Vemuri GN, et al. Unravelling evolutionary strategies of yeast for improving galactose utilization through integrated systems level analysis. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(29): 1217912184.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

需研究的问题：

1.进化代谢装置的搭建及其原理；

2.菌株的筛选方法及其突变菌株的传代稳定性问题；