双螺旋DNA中的G-四链体形成机制研究开题报告

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1. 研究目的与意义

G-四链体结构（G-quadruplex，以下简称G4）是一种由富含鸟嘌呤的核酸序列所构成的四股型态，其形成序列广泛分布于多种生物的基因组中。据测算，人的基因组包含大约37600个潜在的G4形成位点，并且这些位点往往分布在具有重要功能的区域。除了端粒3悬突以外，基因组中G4结构形成序列大多分布在双链DNA中间,这些序列不仅有互补链与之配对,两侧还有双链DNA限制，G4结构的形成需要双链的去稳定甚至解离。因此，对于双链DNA中双螺旋（duplex）结构与G4（G-quadruplex）结构的竞争研究显得尤为重要。本项目将构建含有G4形成序列的双链DNA分子，研究在不同生理条件下，G4结构形成的可能性及结构特点，从而为研究G4有关的基因调控过程以及相关靶向药物设计奠定必要的理论及实验基础。

2. 国内外研究现状分析

有学者认为，在复制、转录等细胞过程中，存在双链DNA的解链,短暂存在的游离单链为G4结构的形成创造了机会(Neaves, Huppert et al. 2009)。也有学者在探究人端粒DNA形成G4结构和双链DNA的平衡动力学常数时发现, G4结构的稳定能力远远不足以抵抗互补双链的配对(Zhao, Kan et al. 2004)，即复制或者转录过程形成的G4很容易因互补DNA的配对而消失。日本的Sugimoto教授课题组发现，在PEG 构建的分子拥挤环境中原先热力学稳定的双链DNA 结构转化成了G4 结构。进而他们提出，在分子拥挤条件下Watson-Crick氢键配对变得脆弱，而Hoogsteen氢键则变得更加牢固(Miyoshi, Matsumura et al. 2004, Miyoshi, Fujimoto et al. 2013)。我国的谭铮教授课题组在分子拥挤对G4构型影响方面也做了很多突出的工作，他们研究了在长双链DNA 中，一段富含G 的区域在分子拥挤条件下的形态。在这项工作中，因为这些富含G的序列都被禁锢在长的双链之中，它们要形成G4结构必须脱离互补链的束缚，而分子拥挤环境给这些G4结构的形成提供了条件。这项发现揭示了基因组DNA在体内环境下形成G4结构在热力学上的可能性(Zheng, Chen et al. 2010)。

对于负超螺旋能否真正引起并稳定G4结构，Hurley教授认为，DNA转录过程中将会产生局部的负超螺旋，而G4结构的产生，能够抵消DNA分子由于负超螺旋而产生的扭转力(Sun and Hurley 2009, Brooks, Kendrick et al. 2010)。指导教师通过构建富含G的环状DNA分子，发现在促旋酶（DNA gyrase，能够将负超螺旋引入DNA分子）作用下，G4结构能够在细胞条件的K 浓度下稳定存在(Lv, Li et al. 2013)。尽管如此，对于G4结构的稳定形成与DNA负超螺旋之间的关系，迄今为止还没有系统化的研究和报道。

3. 研究的基本内容与计划

（1）构建含有g4序列的线性双链dna；(2)构建含有g4序列的环状双链dna；(3)检测促旋酶能否引起g4结构的形成；(4) 通过调节离子种类、浓度、ph等条件，优化g4形成的最佳条件；（5）通过原子力显微镜观察环状dna中的g4结构。

开题时间：为2016-2017学年第二学期的第1-2周。

中期检查: 第8-9周进行毕业论文的中期检查工作。

4. 研究创新点

本课题将从DNA超螺旋角度出发，通过精确调控DNA分子的超螺旋状态，深入探讨G4与双螺旋结构之间可能的互变机制，为研究G4有关的基因调控过程以及相关靶向药物设计奠定必要的理论及实验基础。