米曲霉AodevR基因敲除菌株的构建以及它的表型分析开题报告

1. 研究目的与意义

曲霉菌占空气中真菌的12%左右，主要以枯死的植物、动物的排泻物及动物尸体为营养源，为寄生于土壤中的腐生菌。曲霉菌广泛分布在谷物，土壤，和有机体上，对有机物的分解起着重要的作用。因此，曲霉菌不仅是重要的环境微生物，同时也是发酵工业和食品加工业方面的重要菌株。常见的曲霉菌有黄曲霉、烟曲霉、米曲霉、和黑曲霉等。

米曲霉菌丝一般呈黄绿色，酸度较大的培养基上呈绿色，酸度较小的培养基上呈黄色，老化后逐渐为褐色；具有丰富霉系，稳定性高，耐高温。在蛋白酶的作用下，可将蛋白质转化为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，且可使辅料中粗纤植物酸等难吸收的物质降解，提高营养价值。

曲霉菌的主要传播方式是通过分生孢子扩散, 粘附, 以及入侵的方式。分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形。培养适温37℃。米曲霉主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处，是我国传统酿造食品酱、酱油和酒类的生产菌。

2. 国内外研究现状分析

到目前为止, 国内外学者对米曲霉等曲霉已经做了一些相应研究，如对BrlA, AbaA, WetA, LaeA,以及VeA等分生孢子形成相关因子及其相关途经的研究 (Yu, 2010; Ogawa et al., 2010)。一些研究已经表明, 这些基因中如LaeA同时还有调控多种次生代谢产物 (包括各种毒素) 的作用 (Kale et al., 2008)。LaeA基因的敲除不仅减少了分生孢子的形成, 同时在黄曲霉中, 一些毒素如黄曲霉毒素(Aflatoxin)和环匹克尼酸（Cyclopiazonic acid，CPA) 的产量也有所减少。近年的研究表明,LaeA还卷入了烟曲霉胶霉毒素 (Gliotoxin) 的生物合成 (Sugui et al., 2007)。

除了分生孢子以外，一些研究已表明菌核形成能力和菌核形态也可能与曲霉菌的毒性相关 (Geiser et al., 2000)，但是其分子调控机制尚未明确，后续的研究也进展缓慢。菌核是由多个菌丝分化、缠绕、融合而形成的耐久性构造, 意味着与菌株的生存力密切相关。并且它的表面还形成黑色素沉积, 可保护其抵抗外界破坏。近年的研究表明，菌核构造还与有性生殖密切相关。在长期被认为只有无性生殖的黄曲霉和烟曲霉的成熟菌核内部，被发现有有性孢子的存在 (Horn et al., 2009；O'Gorman et al., 2009)。

3. 研究的基本内容与计划

1.基因敲除菌株的构建。首先利用fusion pcr方法扩增并构建基因敲除用dna融合片段，并利用pyrg作为选择性标记基因，把扩增的基因敲除用dna片段导入米曲霉中，从而构建devr基因敲除菌株。

2.基因敲除菌株的证明。从获得的转化体中提取基因组，并以此基因组为模板，利用设计的引物进行扩增，通过pcr实验证明所获得的转化体是devr基因敲除菌株，并通过southern blot实验进一步证明这一结论。

3.基因敲除菌株的表型分析。获得的基因敲除菌株在各种培养条件下的表型分析：如营养，饥饿，各种压力培养条件下所展示的表型特征，通过这些表型观察，分析转录音子devr在菌株生长过程中的功能和可能承担的角色。

4. 研究创新点

目前国内外在对bHLH蛋白家族的研究基本集中于动植物，在曲霉菌中的研究较少。本研究希望通过观察基因敲除菌株的表型及对其进行分析，有利于进一步阐明bHLH转录因子家族在丝状真菌生长过程中所承担的角色。