重组全序列Tau蛋白及其点突变的原核表达与纯化研究开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述）

微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常脑中tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。tau蛋白基因位于17染色体长臂，由17个外显子和16个内含子组成。正常人中由于tau蛋白mrna剪辑方式不同，可表达出6种同功异构体。tau蛋白为含磷酸基蛋白，正常成熟脑中tau蛋白分子含2～3个磷酸基。而阿尔茨海默症（老年痴呆症）患者脑的tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子tau蛋白可含5～9个磷酸基，并丧失正常生物功能。tau蛋白的磷酸化状态受蛋白激酶和蛋白磷脂酶共同调节，当激酶活性升高，脂酶活性下降时，tau蛋白出现过度磷酸化状态，由于tau蛋白磷酸化位点的多样性，促进磷酸化的激酶也呈现多样性。

在许多神经退行性疾病，tau蛋白形成了不溶性的神经元纤维缠结(nfts)。国际学术界将这种神经细胞中有异常tau蛋白沉积的神经退行性疾病称之为tau蛋白病，如进行性核上瘫、大脑皮质基底核退化症、脑炎后巴金森症候群、第17号染色体异常导致的额颞叶型痴呆伴巴金森症等。至于nffs的存在是因还是果，nfts有无细胞毒作用，目前仍有争议。最近研究发现，表达tau突变体的转基因鼠在出现认知障碍和nfts的病理改变后，如果抑制tau突变体的进一步表达，尽管nvts仍持续存在，但其认知障碍和神经元的丧失均可改善，提示tau的聚集体的形成不是导致tau病理的原发机制，而可溶性的tau中间体在神经元变性中起着重要作用。因此，对tau致病机制的研究将有助于理解神经退行性疾病的发病机制，以便为这类疾病的预防和干预提供新的思路。

由于tau蛋白的异常修饰涉及多种酶，可在此基础上发展新的治疗阿尔兹海默症药物。应用磷酸酯酶及该酶激活剂类药物，降低tau蛋白磷酸化过程，可能对阿尔兹海默症患者的神经元纤维退化有抑制甚至逆转的作用。也可考虑用分解糖基的特异糖苷酶，限制tau蛋白的异常糖基化。

2. 研究的基本内容与方案

1.基本内容

该实验的主要内容是重组全序列tau蛋白及其点突变的原核表达与纯化研究，通过反向pcr构建tau 蛋白的点突变体，将质粒引入感受态大肠杆菌bl21，完成全序列tau蛋白及其点突变的表达研究，完成全序列tau蛋白及其点突变的纯化研究。

2.目标

3. 研究计划与安排

第1-2周： 了解论题，认识所需完成的主要内容和任务；搜集相关学术期刊、论文、文稿、专利、教材等资料，阅读后进行总结，对论题形成一个初步的系统性的认识。

第3-4周： 完成毕业论文开题报告，确定实验技术路线，确定添置实验所需的材料、仪器和试剂。确定具体的实验方案和步骤。

第5-6周： 用氯化钙法制备感受态细胞，将带有tau蛋白基因的质粒扩增，设计带有点突变的引物，通过反向pcr将点突变引入质粒，在通过筛选pcr选出引入突变的质粒，将质粒引入制备好的感受态大肠杆菌。筛选出导入质粒的大肠杆菌。

4. 参考文献（12篇以上）

[1] s barghorn，j biernat，e mandelkow；purification of recombinant tau protein and preparation of alzheimer-paired helical filaments in vitro；humana press, 2005, 299:35-51

[2] 梁燕, 王海萍, 冯利杰,等. 人tau融合蛋白的原核表达及纯化[j]. 安徽医科大学学报, 2007， 42(04): 367-370.

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