石豆兰属药用植物及其混淆品的条形码鉴定研究开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述）

石豆兰属（bulbophyllum）是兰科(orchidaceae)石豆兰亚族下3个属之一，是兰科最大的属，全世界约有1000种，主要分布于亚洲、非洲和美洲热带地区，也见于大洋洲，以东南亚最多。我国有98种3变种，主要产于长江流域及其以南各省区，尤以云南南部为多。石豆兰属植物中的一些种类时常用的中草药，如麦斛、芳香石豆兰、伏生石豆兰、梳帽卷瓣兰等，具有滋阴降火、清热化痰，生津养胃的功效，主要用于治疗肺燥咳嗽、肺结核咳血、热病烦渴，或跌打损伤、疮疖等。其中常作民间药用的有15种，以全草或假鳞茎晒干或鲜草入药，石豆兰属药用植物已经越来越受到国内外中药界的关注。此外，该属植物部分种如广东石豆兰（b .kwangtungense）、密花石豆兰（b .odoratissimum）、大苞石豆兰（b .cylindraceun）和石豆兰（b .inconspicuum）等近缘植物在沿海一带及港、澳地区常作伪石斛使用。国内外对著名中药石斛（兰科石斛属dendrobium多种植物的茎）的开发应用较多。但是，石斛属植物生长环境比较苛刻，并且环境恶化和人类的过度开采，导致该资源极度稀缺，有些物种已经濒临灭绝。由此，虽然石豆兰属植物的药用早有记载，但多有混淆，不仅属内容易混淆，市场上与石斛属药材的混淆也极为常见，造成药材滥用、药材质量无法保证的现象。因此对石豆兰属的药用植物进行鉴定研究，简便、准确地鉴定石豆兰属植物及其易混淆品，对保障药材使用的有效性和安全性具有重要的意义。

石豆兰属植物中一些种类在在民间有药用的经验和历史，但其化学成分和药理研究很不充分。石豆兰属植物含有同科石斛属植物相同结构类型的菲类、联苄、黄铜、酚酸和木脂素等成分，以菲类和联苄类为主要成分，有些成分与石斛属成分相同，但这些成分的药理活性基本没有进行。菲类和联苄类是近年来石斛属植物中发现具有重要生物活性的成分，具有抗肿瘤，抗氧化，抗病毒和抗血小板聚集等活性。由于这些成分的药理作用和生物活性研究还不是很全面，且其作用机制和构效关系的报道很少，为了能够准确的鉴定石豆兰属植物及其混伪品，应用dna条形码技术对其进行鉴定研究。近几年dna条形码技术在生物分类和鉴定方面发展迅速，尤其在中药鉴定中，陈士林课题组通过大量样本实验研究提出its2 psba-trnh 为主体的植物类dna条形码鉴定体系，该体系具有良好的准确性与稳定性，同时对于少数的中药its2 psba-trnh序列还不足对其进行准确的鉴定，所以需要结合其他基因序列来进行鉴定。

本文应用dna条形码技术对石豆兰属的药用植物进行鉴定研究，简便、准确地鉴定石豆兰属植物及其易混淆品共12种，对保障药材使用的有效性和安全性具有重要的意义。

2. 研究的基本内容与方案

2.1研究目标

找出适合石豆兰属植物及其混伪品样品的DNA提取方法，获取DNA条形码序列，进行DNA条形码候选序列的barcodinggap检验，从“ITS2、ITS、psbA-trnH、matK、rbcL”等引物中筛选出最适于石豆兰属药用植物的国际通用条形码序列，建立石豆兰属药用植物DNA条形码鉴定体系，并对其进行比较和评价。

2.2研究内容

（1）石豆兰属药用植物及其混伪品DNA条形码分子鉴定部分：12个物种的原植物和混伪品样本及药材样本的收集及专家鉴定，应用不同方法进行实验样本DNA的提取，探索改良后分别针对石豆兰属中药材原植物及药材的DNA提取最佳方案，从ITS2、ITS、psbA-trnH、matK、rbcL等引物中筛选出扩增效率最高并能将石豆兰属药用植物及其混伪品均较好地区分开来的引物序列，建立石豆兰属药用植物及其混伪品的DNA条形码鉴定体系。

（2）石豆兰属药用植物及其混伪品DNA条形码的比较与评价：对石豆兰属药用植物及其混伪品的DNA条形码序列进行比较，将其区分开来，并对序列进行评价。

2.3拟解决的关键问题

建立一种“快速、准确、方便”的鉴定石豆兰属药用植物及其混伪品的分子生物学鉴定方法，实现快速准确鉴定，规范其市场，加强品种来源鉴定，保障其合理安全用药。

2.4技术方案

(1)实验材料的收集与鉴定

(2)DNA提取方法的选取

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA试剂盒(TianagenBioceth Co，China)提取总DNA，在此方法及基础上，结合传统CTAB法，改良并逐步优化提取方案，使提取效率达到最高。

(3) PCR扩增引物的筛选和体系配置

设计并合成以上各组DNA条形码通用引物，选择部分实验样本，分别运用不同引物片段配置不同PCR体系，并在不同的PCR扩增程序下对实验样本分别进行扩增，得到不同组的PCR产物。

国际通用的DNA条形码引物序列有以下几种：

表1 几种常用的国际通用引物序列

PCR反应体系的配置：

表2 反应体系（25 uL）的配置

几种通用引物的PCR扩增程序设置：

表3 PCR扩增程序

(4) 琼脂糖凝胶电泳检测

制备1%的琼脂糖凝胶，加入核酸染料，插入梳子，待其冷却凝固后，将4 uL PCR产物分别加入点样孔，插上正负极连接线并启动电泳仪，使DNA自负极向正极移动，电泳电压为120 V左右，电泳15-20 min，完成后切断电源。将胶块取出置于302 nm 波长的紫外灯下查看结果，选取条带明亮，且清晰单一的PCR产物送测序公司测序，没有检测出条带的要分析原因，并改善实验方案，再进行以上操作。

(5) PCR产物测序及数据处理与分析

获得测序公司返回的峰图，采用Codon Code Aligner V 4.1（Codon Code， Dedham， MA，USA）对测序峰图进行校对拼接，去除引物区。将获得的各组序列用软件MEGA5.0（molecular evolutionary geneticsanalysis）进行序列分析比对，并基于K2P模型进行遗传距离等分析，用邻接（NJ）法构建系统聚类树，利用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。确定扩增效率最高且鉴定效果最佳的引物序列，建立石豆兰属药用植物及其混伪品的DNA条形码鉴定体系。

3. 研究计划与安排

第1-2周：查阅相关文献资料，明确研究内容，了解研究所需的实验仪器和药品试剂。确定方案，完成开题报告。

第3-12周：根据方案，开展实验项目。

第13-14周：完成并修改毕业论文。

4. 参考文献（12篇以上）

1.shilinchen,jiangxu,changliu,ect.genomesequenceofthemodelmedicinalmushroomganodermalucidum.natcommun.2012jun26;3:913.

2.xiaohuipang,changliu,shilinchen.utilityofthetrnh-psbaintergenicspacerregionanditscombinationsasplantdnabarcodes:ameta-analysis.plosone.2012;7(11):e48833.

3.junqian,haibinxu,shilinchen.genome-wideanalysisofsimplesequencerepeatsinthemodelmedicinalmushroomganodermalucidum.gene.2012oct13.