基于ITS2和psbA-trnH序列对虾脊兰属植物进行鉴定开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述）

1、目的及意义

1.1课题研究的目的、意义

虾脊兰属（calanther.br.）隶属于兰科，大部分为地生种，少数为附生兰，是兰科中一个十分受喜爱的属，虾脊兰属野生种具体有多少种，各植物志中记载不一，《中国植物志》中记载，虾脊兰属植物全属约150种，分布于亚洲热带和亚热带地区、新几内亚岛、澳大利亚、热带非洲以及中美洲，我国为虾脊兰属植物次生分布区，有49种，5变种。虾脊兰属植物叶片较大花色丰满、姿态优美、具有较高的观赏价值，可做盆栽、切花、园林植物等，其中很多种也是很好的药用植物，如虾脊兰（calanthediscolor）、剑叶虾脊兰（calanthedavidii）、钩距虾脊兰（calanthegraciliflora）等的假鳞茎和根部具有清热解毒、散瘀止痛的功效，主治胃溃疡、慢性肝炎、慢性咽炎、关节损伤、跌打损伤等，虾脊兰c.discolor和c.liukiuensis中含有靛玉红、靛红等药用成分，能促进皮肤血液循环。国内对虾脊兰属植物的应用基本依赖于野生资源，由于其观赏价值和药用功效广泛，所以市场上人们大量挖掘，这样难免对它的资源及环境造成破坏，使其成为濒危物种。然而虾脊兰属植物分类复杂，因为不同种类植物特征性状不明显，所以给虾脊兰属植物的鉴定带来很大的困难，且兰科植物也是生物多样性保护的旗舰类群之一，而虾脊兰属作为兰科植物的一种，在中国物种红色名录第一卷将其全部物种都列为珍惜濒危物种。所以，寻找一种快速有效鉴别虾脊兰属植物的方法对于虾脊兰属植物具有长远意义。目前为止，对于虾脊兰属植物的鉴定研究较少，一般只有传统的鉴别方法，而传统的鉴别对于虾脊兰属资源短缺现状来说是非常不利的。dna条形码技术为直接利用dna序列进行物种的鉴定,具有独一无二的可重复性,为药用植物鉴定带来了新的机遇。

2. 研究的基本内容与方案

2.1研究内容

虾脊兰属DNA条形码分子鉴定：7种虾脊兰属植物：南方虾脊兰（Calanthelyroglossa）、棒距虾脊兰（Calantheclavata）、肾唇虾脊兰（Calanthebrevicornu）、虾脊兰（Calanthediscolor）、剑叶虾脊兰（Calanthedavidii）、钩距虾脊兰（Calanthegraciliflora）、三褶虾脊兰（Calanthetriplicata）分别来自河南、利川、广西等不同地区，共计31份样品，所有材料经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所的基原植物样本及药材样本的收集及专家鉴定，应用不同方法进行实验样本DNA的提取，探索改良后虾脊兰属原植物及药材的DNA提取最佳方案，基于ITS2、psbA-trnH和matK序列等引物中筛选出扩增效率最高并能将虾脊兰属均较好地区分开来的引物序列，建立虾脊兰属中药材DNA条形码鉴定体系。

2.2研究目标

①采用DNA条形码技术对虾脊兰属31个品种的基原植物和药材进行分子水平上的鉴定，找出适合虾脊兰属原植物叶片和根茎类药材的DNA提取方法，对DNA条形码候选序列进行barcodinggap检验及构建DNA条形码鉴定体系。

②建立一种“快速、准确、方便”的鉴定虾脊兰属中药材的分子生物学鉴定方法，实现虾脊兰属中药材快速准确鉴定，规范其市场，加强品种来源鉴定，保障其合理安全用药。

2.3拟采取的技术方案及措施

2.3.1DNA条形码分子鉴定部分

研究方法：

①实验材料的收集与鉴定

7种虾脊兰属植物：南方虾脊兰（Calanthelyroglossa）、棒距虾脊兰（Calantheclavata）、肾唇虾脊兰（Calanthebrevicornu）、虾脊兰（Calanthediscolor）、剑叶虾脊兰（Calanthedavidii）、钩距虾脊兰（Calanthegraciliflora）、三褶虾脊兰（Calanthetriplicata）分别来自河南、利川、广西等不同地区，共计31份样品。

②选取DNA提取方法

采用北京天根生化科技有限公司的植物基因组DNA试剂盒(TianagenBiocethCo，China)提取总DNA，在此方法的基础上，结合传统CTAB法，改良并逐步优化提取方案，使提取效率达到最高。

③PCR扩增引物的筛选和体系配置

设计并合成以上各组DNA条形码通用引物，选择部分实验样本，分别运用不同引物片段配置不同PCR体系，并在不同的PCR扩增程序下对实验样本分别进行扩增，得到不同组的PCR产物。

国际通用的DNA条形码引物序列有以下几种：

③PCR扩增引物的筛选和体系配置

设计并合成以上各组DNA条形码通用引物，选择部分实验样本，分别运用不同引物片段配置不同PCR体系，并在不同的PCR扩增程序下对实验样本分别进行扩增，得到不同组的PCR产物。

国际通用的DNA条形码引物序列有以下几种：

表1几种常用的国际通用引物序列

PCR反应体系的配置：

表2反应体系（25uL）的配置

几种通用引物的PCR扩增程序设置：

表3PCR扩增程序

④琼脂糖凝胶电泳检测

制备1%的琼脂糖凝胶，加入核酸染料，插入梳子，待其冷却凝固后，将4uLPCR产物分别加入点样孔，插上正负极连接线并启动电泳仪，使DNA自负极向正极移动，电泳电压为120V左右，电泳15-20min，完成后切断电源。将胶块取出置于302nm波长的紫外灯下查看结果，选取条带明亮，且清晰单一的PCR产物送测序公司测序，没有检测出条带的要分析原因，并改善实验方案，再进行以上操作。

2.4技术路线：

3. 研究计划与安排

3.研究进度安排

1-2周：查阅相关文献资料，明确了解研究内容，了解研究所需的实验仪器和试剂。确定方案，完成开题报告。

第3-12周：完成实验样本的搜集工作，结束全部样品的dna提取、pcr扩增、测序。

4. 参考文献（12篇以上）

4.参考文献

[1].genomesequenceofthemodelmedicinalmushroomganodermalucidum.shilinchen,jiangxu,changliu,ect.natcommun.2012jun26;3:913.

[2].utilityofthetrnhpsbaintergenicspacerregionanditscombinationsasplantdnabarcodes:ameta-analysis.xiaohuipang,changliu,shilinchen.plosone.2012;7(11):e48833.