基于疫木的松材线虫实时PCR检测精度研究开题报告

1. 研究目的与意义

由于松树体内寄生线虫种类多，且有些松树寄生线虫之间的形态差异较小，往往还存在一些形态特征重叠的现象，这都给松材线虫的鉴定带来了难度。因此，许多学者开始寻求分子检测技术途径。线虫的DNA较为稳定，适合于作为鉴定物质。随着分子生物学的发展，尤其是PCR技术的发展，线虫的分子鉴定方法越来越多，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳的同工酶分析技术、DNA杂交技术、RAPD技术、ITS-PCR技术、实时PCR检测技术、PCR SSCP技术等均在松材线虫的分子检测中发挥了重要作用。其中实时PCR检测技术与传统的PCR 相比,其污染可能是最低的,检测需要的时间更短,灵敏度高(朱水芳,2003) 。用实时PCR 技术检测松材线虫,符合有害生物检疫检验工作中所要求的简单、快速、准确、灵敏的标准,在实践中具有重要的推广应用价值。但在检测精度方面，为了精益求精，还需深入对实时PCR技术检测精度进一步进行研究。

2. 国内外研究现状分析

张卫东等（2005）利用荧光PCR从美国进境的木质包装材料中成功检出松材线虫。探针检测松材线虫样品时，可产生明显的荧光信号，但空白水对照、小杆线虫( Rhabditida)、拟松材线虫无荧光信号，表明探针有较强的特异性。王明旭等（2005）以松材线虫rDNAITS2为靶区，建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明，探针检测松材线虫和拟松材线虫时，前者产生明显的荧光信号，后者无荧光信号，探针具有高度的特异性。探针检测到最低模板浓度为1pg /μL，DNA测序结果与实时荧光PCR结果一致。该方法无需进行DNA 的提取,提高了检测的速度,整个过程不到3 h ,适用于松材线虫的快速检测。Cao A X 等（2005）在松材线虫rDNA内部转录区，设计了一对实时PCR引物和特异探针，采用实时定量PCR方法成功检测松材线虫。可检测出松材线虫DNA的最低浓度为0.01ng。叶建仁等（2008）利用探针TapMan-MBG与其配套的引物对F/R对来自国内松材线虫病发生区以及部分口岸截获的松材线虫样本都表现出阳性增信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑韧线虫、大核滑韧线虫、长尾属线虫以及空白对照均表现出阴性。在10μL的反应体系中，其检测灵敏度达0.5pgDNA。殷幼平等（2007）以cqubs01/cquba01为引物，用于SYBR GreenI实时荧光PCR检测，采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、小杆线虫、伪伞滑韧线虫、滑韧线虫和其他腐生线虫进行检测，经过多次的PCR验证，结果显示能准确检测出松材线虫，而对拟松材线虫、小杆线虫、伪伞滑韧线虫、滑韧线虫和其他腐生线虫不能检出，灵敏度达到100fg/25μL。陈凤毛等（2008）根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F₁₁/R₁₁与探针TaqMan-11，构成松材线虫实时PCR检测方法。采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测。结果显示，所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号，而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号。表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性。此外，该检测方法非常灵敏，在10μL的反应体系中，最少可以检测到0.005pg的松材线虫DNA含量。陈凤毛等（2011）通过特异引物的PCR合成DIG探针，采用探针DIG － F2 /R1对线虫基因组DNA 进行点杂交， 19 个松材线虫株系均表现有较强的杂交信号，而8 个拟松材线虫、1 个霍夫曼尼伞滑刃线虫、1 个大核滑刃线虫、1 个长尾属线虫等均无杂交信号。且用该探针准确稳定地检测出单条松材线虫，对检疫工作非常有价值。

3. 研究的基本内容与计划

4. 研究创新点

本课题直接采用松木为实验对象的基于实时PCR技术的快速分子诊断技术的基础上，研究疫木检测的准确性与精度。

从而为松材线虫病防控中的疫情监测、松木检疫两个最关键环节尽快提供快速高效的防控技术。