松材线虫几丁质酶基因Bxcht1的功能学研究开题报告

1. 研究目的与意义

松材线虫病是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起一种松树毁灭性病害。我国1982年首次在南京中山陵发现该病，现已逐渐在江苏、安徽、广东等17个省（自治区）的部分地区蔓延成灾，发生面积达10万hm2，累计致死松树3500多万株，直接经济损失25亿元，间接损失250亿元。近年来疫情扩散蔓延呈加剧之势，目前已逼近黄山等著名风景名胜区、世界自然文化遗产和重点生态区域，并已对我国大面积松林构成了严重威胁，是我国最具危险性的头号森林病虫害。 由于松材线虫具有能进行体外活体培养的特性，在实验室中松材线虫取食灰霉等真菌。由于真菌的细胞壁的重要成分是几丁质，开展松材线虫几丁质酶等真菌细胞壁成分代谢相关基因的克隆与功能分析将有助于我们阐明松材线虫生活史关键阶段的取食与寄生机制，为有针对性开展松材线虫的致病机理研究及其有效的防治策略奠定基础。

2. 国内外研究现状分析

从1921年Folpmers首次从细菌和放线菌中获得有水溶性几丁质酶存在以来，人们又相继从多种微生物、动物及植物中分离到几丁质酶。几丁质酶是一种糖苷酶，它主要催化几丁质的水解。植物几丁质酶分为内切酶和外切酶两种，目前研究的大多数为几丁质内切酶，它可水解几丁质内部的β-1, 4链，释放GLCNAC寡糖；而外切酶则从链的非还原端依次切下几丁质二糖。许多纯化的几丁质内切酶还显示不同程度的溶菌酶活性。能水解肽葡聚糖中N-乙酰胞壁基与GLCNAC残基的β-1, 4链。

目前在松材线虫上研究较多的水解酶为GHF家族的水解酶类，其中GHF45家族蛋白研究最多，内切β-1, 4葡聚糖酶基因的催化活性位点与真菌短帚霉和米根霉的GHF45家族高度相似，而在自由生活线虫秀丽隐杆线虫和 Caenorhabditis briggsae的全基因组中并没有发现GHF45家族基因，因此认为该类基因可能通过水平基因转移的方式从真菌中获得。真核表达产物分析表明，松材线虫的Bx-eng-1是以非糖基化的单体形式存在，而Bx-eng-2和Bx-eng-3是以糖基化的二聚体形式存在，体外表达产物的酶学性质分析表明三者具有相似的酶学特性。研究表明，dsRNA浸泡24h能显著导致该基因的转录后基因沉默效应，降低其纤维素酶活性，同时浸泡处理能显著减少F1 的线虫个体数量，因此认为该基因可能在松材线虫的致病性和线虫的取食、发育和繁殖中发挥作用。

3. 研究的基本内容与计划

主要研究内容：

（1）松材线虫几丁质酶基因bxcht1原核表达载体构建

（2）松材线虫几丁质酶基因bxcht1的原核表达与产物纯化

4. 研究创新点

松材线虫具有能进行体外活体培养的特性，在实验室中松材线虫取食灰霉等真菌。由于真菌的细胞壁的重要成分是几丁质，开展松材线虫几丁质酶等真菌细胞壁成分代谢相关基因的克隆与功能分析将有助于我们阐明松材线虫生活史关键阶段的取食与寄生机制，为有针对性开展松材线虫的致病机理研究及其有效的防治策略奠定基础。