pelB引导的内切菊粉酶基因在大肠杆菌中的表达及其产物分析开题报告

1. 研究目的与意义

菊粉是由β-呋喃果糖以β-2,1-糖苷键相连，并在其还原端接一个α-吡喃葡萄糖基的果聚糖。菊粉呈直链结构，聚合度（DP）为2～60，相对分子质量在3500～5500之间。它主要存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鲜蓟等植物体的根部或茎部，是一种来源丰富的可再生资源。

菊粉酶是一类能水解菊粉生产果糖和果聚糖的酶。前期实验中，将一个来源于黑曲霉的内切菊粉酶基因在大肠杆菌（Escherichia coli BL21(DE3)）中成功表达。为了进一步提高重组菊粉酶在大肠杆菌中的高效表达，本研究将PelB信号肽融合到内切菊粉酶成熟蛋白的N端。PelB可将目的蛋白引导质周质空间。本研究实现重组内切菊粉酶基因在大肠杆菌中的表达，并考察信号肽对重组内切菊粉酶表达的影响。在此基础上，以菊粉为原料，考察了该内切菊粉酶水解菊粉所得低聚糖的特征。

2. 国内外研究现状分析

菊粉酶（Inulinase） 是一种催化裂解菊粉（Inulin）中β-2,1 糖苷键的水解酶，产物多为果糖和低聚果糖^[1]。菊粉酶具有两种作用方式，一种为外切型，从非还原端逐个水解β-2,1 糖苷键，生成一分子果糖和少一个果糖单位的果聚糖；另一种为内切型，水解菊粉多糖链内部的β-2,1 糖苷键，产生降低了聚合度的低聚果糖^[2]。低聚果糖是一种双歧因子，可用作功能性食品或饲料添加剂，被称为原生素（PPE）^[3]。

可通过菊粉酶的催化作用，以菊粉为原料,生产高果糖浆、低聚果糖、乙醇、丙酮2丁醇或琥珀酸等产品。这些产品由于具有广阔的应用前景，促使国外很多学者从20 世纪80 年代就开始深入开展菊粉酶的研究^[4]。毫无疑问，微生物合成是生产大量的工业用酶的唯一方法，30 年来许多学者致力于寻找生产菊粉酶的最好微生物，尤其是日本、韩国和欧洲在这方面积累了丰富资料。我国关于菊粉酶的研究始于20 世纪90 年代,主要研究集中于菌株筛选和酶学性质方面。近十年来,本实验室也利用无花果曲霉产菊粉酶进行了研究。因此，针对微生物菊粉酶，综述了近年来国内外关于微生物菊粉酶生产、生物化学特性及分子生物学等方面的最新研究进展。

3. 研究的基本内容与计划

（1） 内切菊粉酶基因的克隆

该内切菊粉酶基因来源于实验室一株黑曲霉，之前实验中已将该基因克隆，以前期实验获得的质粒petduet-inu1为模板，pcr克隆该内切菊粉酶基因。

（2） 内切菊粉酶基因重组表达质粒的构建

4. 研究创新点

本研究将PelB信号肽融合到内切菊粉酶成熟蛋白的N端，进一步提高重组菊粉酶在大肠杆菌中的高效表达。PelB可将目的蛋白引导至周质空间。本研究实现重组内切菊粉酶基因在大肠杆菌中的表达，并考察信号肽对重组内切菊粉酶表达的影响。在此基础上，以菊粉为原料，考察该内切菊粉酶水解菊粉所得低聚糖的特征。