樟疫霉检测靶标的发掘与快速检测技术研究开题报告

1. 研究目的与意义

樟树是樟属中分布地区最广、应用最多的树种，是重要的城市绿化和造林树种之一; 作为重要的中药及香料植物的肉桂、锡兰肉桂，具有补脾健胃的功效。

樟疫霉( phytophthora cinnamomi)可以引起樟属植物产生疫霉病害，造成极大损失。

樟疫霉可侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造成毁灭性打击。

2. 国内外研究现状分析

樟疫霉属于卵菌门( Oomycota) 、卵菌纲( Oo- mycetes) 、霜霉目( Peronosporales) 、腐霉科( Pythia- ceae) 、疫霉属( Phytophthora) ，可侵染樟属植物引 起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造 成毁灭性打击。据报道，樟疫霉已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性。在中国，樟疫霉还可以危害雪松，造成雪松疫霉腐烂病。樟疫霉广泛分布于美洲、欧洲 以及东亚、南亚和大洋洲等地区，可侵染包括林木 以及农作物在内的超过 3 000 多种植物，是森林病害防治的重要病原菌之一。

樟疫霉属于土传病原菌，其存活、传播均依赖于较为湿润的条件，生活史包括无性阶段和有性阶段，前者包括菌丝和游动孢子形成，后者包括卵孢子、孢囊孢子等形成。气生菌丝可以形成具有多核的孢子囊，经原生质割裂，产生 20 ～ 30 个单核双鞭毛的游动孢子，受到根部特殊物质( 一些氨基酸)的诱导，形成休止孢，遇到合适的条件，可以萌发侵入植物内部，形成气生菌丝然而，气生菌丝若遇到不适合的生长条件，将形成厚垣孢子，条件合适后则可以再次形成气生菌丝，也可以萌发产生孢囊孢子，完成后续游动孢子、休止孢等生活史不同阶段。此外，气生菌丝经 A1 和 A2 交配型完成有性生殖还可以形成卵孢子，从而通过萌发也产生孢子囊，完成后续游动孢子、休止孢等生活史。据报道，卵孢子并不是樟疫霉生活史中所必需的一部分，在 澳大利亚，由于缺少 A1 交配型，卵孢子在樟疫霉 生活史中并不存在。目前樟疫霉检测方法主要有：形态学鉴定法，PCR法，Real-timePCR法等多种方法。形态学鉴定法等传统方法在樟疫霉的检测中发挥了重要作用，但是费时费力且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着分子生物学技术的发展，PCR技术和实时荧光PCR技术已经成功用于检测樟疫霉病菌。虽然这类方法快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养，但是检测时间较长，同时需要依赖精密的温度循环装置，不适合用于基层且欠发达的国家和地区。因此建立一种低成本的快速检测樟疫霉的方法对于樟疫霉的控制非常重要。

3. 研究的基本内容与计划

（1）可视化环介导等温扩增技术的特异性引物的设计：通过对病原卵菌的核心基因的筛选选择具有保守性的引物序列，利用专门针对恒温环式扩增在线软件对不同疫霉菌设计相关的特异性引物（LAMP引物设计网站地址：http://venus.net-laboratory.com/partner/lamp/index.html)；（2）检测样品的制备：取样品少量样品用0.5N NaOH研磨后，取10uL研磨产物迅速稀释到490uL Tris-Cl(pH 8.0)中，其中取1.5uL溶液可直接用于恒温环式扩增，这种样品的制备方式可在5min中之内完成；（3）可视化环介导等温扩增技术：为了摸索最优的环介导等温扩增技术（LAMP)反应体系，对LAMP反应中的检测技术参数进行优化，主要包括：MgSO4浓度（28 mM），内引物的浓度（0.22 μM），dNTPs浓度（0.41.4 mM），甜菜碱浓度（0.21.4 M），HNB浓度（100300 μM），Bst DNA聚合酶添加量（0.320.64 U/μL），不同反应时间（3090 min）进行优化，确定了最终的反应体系；（4）可视化环介导等温扩增技术产物的快速检测：扩增反应前加入羟基萘酚蓝（Hydroxynaphthol dye），反应结束后阳性PCR管中扩增的DNA与染料结合可肉眼直接看到反应产物，阳性呈现天蓝色。（5）特异性分析：以研究设计的特异性引物对樟疫霉的快速分子检测技术进行环介导等温扩增（LAMP）扩增，以水作为阴性对照，并用寄生疫霉、樟疫霉菌、草莓疫霉、辣椒疫霉、掘氏疫霉、恶疫霉、大雄疫霉、终极腐霉、木贼镰刀、平头炭疽、稻瘟病菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌等基因组作为对照以检测LAMP反应的种间和属间的特异性。（6）灵敏度分析：将10倍递度稀释的樟疫霉疫霉菌的基因组DNA （从100 ng μL-1到10 fg μL-1）进行 LAMP反应扩增，于64℃等温条件下反应。检验最低检测灵敏度。（7）确定樟疫霉菌的的环介导等温扩增（LAMP）技术时，要指出是与普通PCR检测技术和Real-time PCR检测技术对比的结果。

论文时间安排：2015.1.20―2014.3.15：查阅文献，做好预备实验；2014.3.16－2014.5.20：针对樟疫霉（Phytophthora cinnamomi），筛选出1-2个分子检测靶标，优化检测技术参数，提高分子检测技术准确率，缩短检测时间，建立致病疫霉菌的快速分子检测技术；2014.5.21－2014.6.1：整理试验数据，撰写毕业论文，准备答辩。

4. 研究创新点

樟疫霉会造成樟属植物根部腐烂和枝干等病害，对樟树植物造成毁灭性的打击，控制传播是减少危害的主要措施之一。

本文首次报道应用环介导等温扩增技术（lamp）检测樟疫霉病菌。

相较于传统的pcr方法，lamp扩增方法具有以下几个特点：1）在等温条件下（60~65℃）就能进行扩增反应，同时反应时间短，仅需1h；2）因为没有变形的过程所以不需要热循环仪器，一个普通的水浴锅挥着等温保温瓶即可进行lamp反应；3）特异性高，4条内引物与靶序列的6个结合区完全匹配的情况下才能进行lamp扩增反应；4）鉴定简便：在大量合成核酸时，从dntps解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合产生副产物焦磷酸酶沉淀，只要用指示剂hnb进行可视化显色方法就可以判断扩增与否，从而实验了扩增结果的快速鉴定。