樟疫霉效应分子的生物学信息分析与转录分析开题报告

1. 研究目的与意义

樟疫霉（Phytophthoracinnamomi）属于卵菌门疫霉属（Phytophthora），广泛分布于欧洲、美洲、东亚、南亚及大洋洲等地区，其寄主广泛，包括樟属植物在内的超过3000多种林木和农作物等。由该菌侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，对樟属植物造成毁灭性的破坏。樟疫霉已经成为林木病害防治的重要病原菌之一，据报道，该菌已造成澳大利亚西南地区森林结构和植物种群的变化，已经成为影响当地自然生态系统以及生物多样性的重要威胁之一。在前人对Ph．cinnamomi的分类地位、危害分布情况以及鉴定方法、遗传关系、生活史等方面进行综述的基础上，笔者以樟疫霉中328457条蛋白序列为基础，首先根据氨基酸长度筛选出长度为50～300个氨基酸的小分子蛋白，然后，利用Signalp、ProtComp、TMHMM、big-PIFungalPredictor和TargetP等预测程序对小分子分泌蛋白进行搜索，最后利用卵菌效应分子的保守motif对该菌的候选效应分子进行确定，以期为深入开展该菌效应分子的功能研究奠定基础。

卵菌基因组存在一类特殊的分泌蛋白，它们是从已鉴定的无毒基因的序列比对中被发现：一般为短蛋白，没有内含子，序列前端的信号肽下游，50-70位氨基酸左右，具有保守的RxLR-dEER元件。RxLR类（R，精氨酸；x，任何氨基酸；L，亮氨酸）效应分子在卵菌逃避植物识别以及卵菌进化过程中均起着重要作用。因RXLR-dEER与卵菌无毒基因具有类似的N端保守结构，因此将这类蛋白称作无毒基因同系(Avrhomologs,Avh)基因。本研究借助重复比对（recursiveBLAST）、隐马尔可夫（HMM）、跨膜结构预测等生物信息学方法，从樟疫霉中筛选出RXLR类效应分子，并对这些效应分子的进化关系和结构域进行分析，从而对后期研究效应分子的毒性功能和作用机制提供重要依据。疫霉菌分泌效应蛋白以改变寄主生理以促进侵染。这些进化速度较快的分泌蛋白主要分布在致病疫霉基因组中基因较分散的区域。致病疫霉编码的众多家族的与致病相关的效应分子，大致分为两类：一类是作用于植物细胞间的质外体（apoplastic）效应分子；另一类则是通过侵染结构吸器（haustorium）被直接转运进入植物细胞的细胞质（cytoplasmic）效应分子。前者包含了分泌的水解酶，如蛋白酶、脂肪酶和糖基化酶等，用于降解植物组织；用于保护病原菌避免被植物防卫酶类破坏的酶抑制剂；引起坏死的毒素，如Nep1-like蛋白（NLP）和PcF-like富含丝氨酸小蛋白（PcF-likesmallcysteine-richproteins,SCRs）。在疫霉属中，候选的效应分子数量众多，且与非致病相关因子比，数量上具有明显的扩张现象，如：分泌到细胞内的RxLR和Crinkler家族的效应分子。对卵菌中存在的大量效应分子进行生物信息学分析，结果表明：RXLR效应分子其N末端RxLR基序两侧30-60个氨基酸之间具有显著的偏好性，具有分泌和转运功能；同时C末端区域变异性较大，可能涉及快速逃避植物或动物R蛋白的检测、并具有操控植物或动物防卫反应的功能。RxLR核心基序对于卵菌效应分子在各自病原系统中的转运是必要的，但是仅仅依靠它们并不能完成全部转运功能，尚需要两翼序列共同来完成其转运功能。

2. 国内外研究现状分析

樟疫霉属于卵菌门( Oomycota) 、卵菌纲( Oo- mycetes) 、霜霉目( Peronosporales) 、腐霉科( Pythia- ceae) 、疫霉属( Phytophthora) ，可侵染樟属植物引 起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造 成毁灭性打击。据报道，樟疫霉已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性。在中国，樟疫霉还可以危害雪松，造成雪松疫霉腐烂病。樟疫霉广泛分布于美洲、欧洲 以及东亚、南亚和大洋洲等地区，可侵染包括林木 以及农作物在内的超过 3 000 多种植物，是森林病害防治的重要病原菌之一。

樟疫霉属于土传病原菌，其存活、传播均依赖于较为湿润的条件，生活史包括无性阶段和有性阶段，前者包括菌丝和游动孢子形成，后者包括卵孢子、孢囊孢子等形成。气生菌丝可以形成具有多核的孢子囊，经原生质割裂，产生 20 ～ 30 个单核双鞭毛的游动孢子，受到根部特殊物质( 一些氨基酸)的诱导，形成休止孢，遇到合适的条件，可以萌发侵入植物内部，形成气生菌丝然而，气生菌丝若遇到不适合的生长条件，将形成厚垣孢子，条件合适后则可以再次形成气生菌丝，也可以萌发产生孢囊孢子，完成后续游动孢子、休止孢等生活史不同阶段。此外，气生菌丝经 A1 和 A2 交配型完成有性生殖还可以形成卵孢子，从而通过萌发也产生孢子囊，完成后续游动孢子、休止孢等生活史。据报道，卵孢子并不是樟疫霉生活史中所必需的一部分，在 澳大利亚，由于缺少 A1 交配型，卵孢子在樟疫霉 生活史中并不存在。

3. 研究的基本内容与计划

1）2015.10.20―2015.11.30：查阅文献，做好预备实验；

2）2015.12.01－2016.5.20：借助重复比对（recursiveblast）和隐马尔可夫（hmm）等生物信息学的方法对樟疫霉rxlr家族进行了分析。在鉴定rxlr效应分子的基础上，构建序列进化树了解基因之间关系；同时鉴定出已经测序的大豆疫霉、橡树疫霉、致病疫霉的rxlr家族的效应分子，并进行进化关系分析。

3）2016.5.21－2016.6.1：整理试验数据，撰写毕业论文，准备答辩。

4. 研究创新点

卵菌基因组中包含有数百个高度分化的RxLR效应分子基因（其中包含已经克隆的几个无毒基因），这些基因被认为存在巨大的功能冗余性，这些基因对于其逃避来自于植物的免疫监督系统（免疫系统的监督）和增加病原菌的适生性具有重要的作用。深入研究效应分子的转运机制以及毒性功能将（有助于）加深对卵菌致病机理的理解。根据已经报道的16个致病疫霉的基因蛋白序列在不同的基因组数据库进行同源搜索，结果表明，在疫霉属基因组中富含CRN基因，其中致病疫霉和大豆疫霉中最多，分别有196个和108个，此外在橡树疫霉、辣椒疫霉、腐霉和寄生霜霉中，也分别有19、26、36和16个。但是，在所有找寻的真菌基因组中，包括子囊菌门，担子菌门，半知菌类，都没有发现基因的存在，证明这组基因是卵菌所特有的。