低毒力病毒CHV1-CN280 p29基因在栗疫菌中的功能分析开题报告

1. 研究目的与意义

板栗具较高的食用与药用价值，栗木具很高的实用性。板栗资源丰富，常分布于山区与半山区地区，土壤贫瘠的地方也能生长。然而，板栗生产中会遭遇很多病虫害侵袭，其中栗疫病菌（cryphonectria parasitica）引起的栗疫病最为严重^[1]，该病在国内外都相当普遍。板栗疫病又称栗胴枯病、栗腐烂病或栗干枯病等，是板栗产区危害最严重的一种病害。近几年受气候和环境等各种因素影响，板栗疫病的发生率呈上升趋势。板栗疫病主要发生在树干和主枝上，发病初期枝干褪绿，并逐渐变为黄褐色的圆形斑点，而后发展成较大的不规则的赤褐色斑块，最后围抱整个树干，并上下扩展。病部略微凹陷，病斑呈水肿状隆起的橙黄色小粒点，即为病菌的分生孢子器，病斑内部湿腐，有酒糟味，病斑干燥后树皮纵裂可见皮内枯黄色病组织^[2]。moffitt和lister等在栗疫病菌的低致病力菌株中分离到dsrna，其对强毒力栗疫病菌的致病作用降低了栗疫病菌对栗树的侵染力^[3]。天然含dsrna低毒力菌株的出现使得濒临灭绝的欧洲栗树林得以恢复。当然，该种致病力作用或侵染力的降低也有可能是低毒力菌株对寄主植物的诱导抗病或位点竞争等保护作用。若干年来，欧美等地用低毒力菌株进行生物防治取得了明显的治疗效果。低毒力菌株以其应用简便、无污染、成本低、效果明显等特点在生物防治中日益受到重视^[4]。

随着板栗疫病菌高效的转化体系、低毒病毒的转染体系的成功建立和低毒病毒的侵染性克隆完成，用芯片杂交技术研究低毒病毒对板栗疫病菌基因表达的影响，研究结果表明，受病毒感染后，295个基因表达水平有显著差异，其中有132个基因表达上调，163个基因表达下调，用northern杂交和mrna差异显示技术证实了该结果，低毒病毒对板栗疫病菌致病基因及代谢途径、信号传导途径等均有明显的影响。用蛋白质二维凝胶电泳和质谱分析方法发现，低毒病毒对板栗疫病菌里的一些蛋白表达有影响，共发现33个相关蛋白表达有差异，其中上调的主要是与初级代谢和能量有关的一些转运蛋白，而下调的主要是囊泡相关蛋白和abc转运蛋白，由此可见，低毒病毒与板栗疫病菌互作关系很复杂^[5]。

1991年，与栗疫菌弱毒相关的第一个弱毒病毒chv1被成功测序，后续相继完成了对chv2（cryphonectria hypovirus2）、chv3（cryphonectria hypovirus3）和chv4（cryphonectria hypovirus4）的基因组测序，但这4个病毒对栗疫菌的弱毒性存在差异。

2. 国内外研究现状分析

国内外关于栗疫病的研究集中在板栗疫病菌基因功能和低毒病毒对板栗疫病菌信号通路的影响等方面。如Gao K等发现板栗疫病菌CpBir1基因与产孢、毒性、抗凋亡作用和影响低毒病毒传播有关^[8]。Kim J M等对CpBck1基因在致病性方面的作用进行了研究^[9]。Turina M等利用敲除Cpkk2基因的方式，揭示了一种复杂的相互作用，它会引起对病毒感染的抗性，这一作用的实现需要三个因素：Cpkk2基因缺失、培养基中含有遗传霉素和neo^r抗性基因的存在^[10]。高坤等对栗疫菌CpIAP基因的生物信息学分析和功能研究，发现CpIAP参与了栗疫病的菌落形态建成、分生孢子形成和致病过程^[11]。李茹对Ntl基因的功能研究，发现Ntl基因缺失不影响低毒病毒CHV1-EP713的复制积累量，但导致参与G蛋白信号传导途径的Cpga1、Cpgb1、Cpgc1和Ste12基因以及参与MAPK途径的Cpmk1转录水平明显下调^[12]。Ko Y H等发现CpCdc48基因对细胞分裂和极化生长是必要的^[13]。Moretti M等通过敲除Cpkk1、Cpkk2和Cpkk3基因的方法，对它们编码的三种MAP2Ks的功能进行了研究，描述了这三种激酶的功能独特性^[14]。

邓清超等人对来自中国的低毒力病毒CHV1-CN280进行了全长测序，序列比对结果表明：该病毒P29蛋白为247 aa，略小于另外3个CHV1病毒的248 aa；P29蛋白部分无论在核酸水平还是氨基酸水平上与已经测序的三个CHV1病毒都存在较大差异，同源性大约只有60%，而其它三个已测序CHV1病毒同源性高达89-98%；推测的活性中心160~163位的GYCY和215位的组氨酸His以及最后的断裂位点都是十分保守的。Suzuki等曾报道EP713的P29 N端24个氨基酸残基与病毒的复制密切相关，一旦缺失，病毒将丧失复制能力，已经测序的三个CHV1病毒的P29蛋白的前24个氨基酸是相当保守的，而我们的序列比对结果表明，CHV1-CN280的P29蛋白与另三个病毒的序列差异非常显著。该病毒的P29蛋白的前24个氨基酸除第一个甲硫胺酸（Met）外，只有13位的亮氨酸（Leu）、23位的谷氨酰胺（Gln）和24位的脯氨酸（Pro）与其它三个CHV1病毒完全相同。由此，本实验将用p29基因连接不同的表达载体，再通过外源DNA导入法，将连接好的表达载体导入栗疫菌中，以对CHV1-CN280病毒的p29基因在栗疫菌中的功能进行研究，并且对CHV1-CN280和CHV1-EP713的基因功能进行异同性分析，以期对中国的低毒力病毒功能有进一步的认识。

3. 研究的基本内容与计划

3.1 研究内容

本文通过外源dna导入法对chv1-cn280病毒的p29基因在栗疫菌中的功能进行研究。首先克隆chv1-cn280病毒的p29基因，将其连接至不同的表达载体并导入栗疫菌的基因组，进一步研究该基因在栗疫菌中表达是否引起菌株色素、孢子量、生长速率以及漆酶活性等类似低毒力性状的改变，并将p29分别在chv1-cn280与chv1-ep713的基因功能进行异同性分析，以期对中国的低毒力病毒的功能特性有进一步的认识。

3.2 研究计划

4. 研究创新点

栗疫病是最著名的森林病害之一，可通过利用低毒病毒来进行生物防治。CHV1-CN280是来自我国北方的一种低毒病毒，具有较高病毒传播能力。对低毒病毒基因组进行研究，有利于提高使用生物防治的方法来对抗栗疫病的成功率。本课题通过对低毒病毒CHV1-CN280的p29基因在栗疫菌中功能的研究，为进一步研究P29以外的蛋白功能具有指导性意义，并对中国的低毒力病毒功能有进一步的认识。