鹅掌楸属DHAR基因原核表达与酶活性研究开题报告

1. 研究目的与意义

通过lcdhar基因的原核表达获得鹅掌楸、北美鹅掌楸dhar基因的编码蛋白，测定其功能活性，结合qpcr定量表达结果，探讨鹅掌楸属dhar基因功能与表达差异。

木兰科(magnoliaceae)鹅掌楸属(liriodendron)树种为第三纪孑遗树种，是被子植物中最原始的类群之一，鹅掌楸属现存两个种：北美鹅掌楸(l. tulipifera linn.)和鹅掌楸(l.chinense sarg.)。北美鹅掌楸广泛分布于美国东部及加拿大东南部，适应性强，常用作园林景观及行道树种；鹅掌楸又名马褂木，零星分布于我国长江流域的亚热带低山、丘陵地带，以及越南北部。鹅掌楸天然更新能力差，种子繁殖适合度低，自然群落中种群数量小，种群内个体数目少，群体间基因交流受到严重影响，处于濒危状态，现已被列入国家二级珍稀濒危保护植物名录。近几十年来，国内外众多研究者对鹅掌楸属树种进行了大量的研究，包括生物学特征、生殖生物学特性、种间杂交育种及遗传多样性等，并取得了较大的进展。

asa是植物体内非常重要的还原剂，能够有效地清除活性氧。脱氢抗坏血酸还原酶（dhar）又叫谷胱甘肽-s-转移酶，主要参与asa的再生循环，因此对于维持活性氧的相对稳定以及逆境适应性有着重要的作用。研究表明超表达的dhar基因可使转基因植株抗干旱、盐和低温能力显著提高。dhar基因作为一种重要的功能标记，在研究属种间适应性进化有着重要的作用。本研究通过dhar基因的原核表达，获得鹅掌楸、北美鹅掌楸dhar基因的编码蛋白，测定其功能活性，并结合qpcr结果，探讨鹅掌楸属种间dhar基因功能与表达差异。

2. 国内外研究现状分析

植物体进行生长、代谢、繁殖等正常的生命活动都需要氧气的参与，分子氧在这一系列过程中主要作为重要的电子受体发挥作用。当叶绿体、线粒体和质膜上的电子传递到分子氧上时，就会产生活性氧。活性氧（ros）在植物抵抗生物与非生物胁迫过程中起着重要的作用，但是升高的ros水平不仅会对细胞内大分子（核苷酸，蛋白质及脂类等）造成严重损伤，还会扰乱细胞的抗氧化能力，而细胞内的抗氧化机制对于维持细胞内的平衡和损伤修护来说是很关键的。为了解决体内升高的水平，植物进化出了两种不同的机制：酶促与非酶促机制。在植物和动物中，抗坏血酸（asa）是非酶促机制重要的水溶性抗氧化剂，可以去除过量有害的活性氧（ros）。脱氢抗坏血酸还原酶（dhar）又叫谷胱甘肽-s-转移酶，主要参与asa的再生循环，补充循环中损失的asa。由于对脱氢抗坏血酸还原酶（dhar）在酶促机制中的抗氧化作用以及在抗坏血酸谷胱甘肽循环中对抗坏血酸的再生作用的发现，使人们逐渐重视对dhar的研究。

目前，已从水稻(urano，2000)、拟南芥(dixon，2002)、番茄(zou，2006)、马铃薯(qin， 2011)以及毛白杨（唐振鑫，2013）等植物中成功克隆出了dhar基因，这为进一步研究该基因的生理代谢功能提供了基础。dhar广泛存在于植物的叶绿体、线粒体和细胞质中,不仅参与植物细胞中asa的再生,而且广泛地参与植物的抗逆反应。研究表明，超表达的dhar基因可使转基因植株抗干旱、盐和低温能力显著提高；在烟草中过量表达小麦dhar基因可使转基因植株提高对臭氧的抗性（chen z,2005），而在马铃薯中过量表达拟南芥dhar基因可使转基因植株对臭氧和干旱胁迫的抗性增强(eltayeb,2006)，在烟草中过量表达拟南芥dhar基因可使转基因植株对铝胁迫的抗性增强（l.yin,2010）。

当今，已成功构建dhar基因原核表达载体，考洪娜于2010年通过定向克隆技术将高山松、油松和云南松dhar基因的编码序列亚克隆到带有6his标签的pet30a表达载体中,转化大肠杆菌bl21感受态细胞，经iptg诱导后发现dhar蛋白都能在大肠杆菌中高效表达。唐振鑫于2013年将酶切纯化后的pet30a载体和回收的目的基因用连接酶进行连接，并将其连接产物转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，结果发现dhar蛋白均能够在bl21菌株中表达。由此成功分离和纯化dhar蛋白，进行下一步酶活性分析。酶学性质分析表明, 高山松与油松dhar1蛋白对底物具有相似的催化活性、催化效率、最适p h和热力学稳定性,但其催化活性比云南松dhar1蛋白高约300倍。高山松dhar2蛋白对底物的催化活性和热力学稳定性均高于油松dhar2蛋白（考红娜，2013）。在对毛白杨进行的实验发现3个dhar蛋白仅对底物dha有催化活性，而且对dha的催化活性有一个较广泛的温度和ph适应范围，在55c时他们均能保留各自最大活性50%以上，在ph值处于6.5-8.5时能保留40%以上的最大活性。在3个dhar蛋白中，ptodhar2对底物gsh表现出最高的亲和力（唐振鑫，2013）。dhar酶学活性的显著差异表示不同dhar基因可能存在功能上的分化。这种功能上的分化与植物的进化之间可能存在一定联系。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：

（1）鹅掌楸与北美鹅掌楸dhar基因原核表达；

（2）dhar蛋白分离纯化；

4. 研究创新点

本研究分别构建了鹅掌楸和北美鹅掌楸DHAR基因原核表达载体，通过原核表达、蛋白分离纯化最终获取到鹅掌楸与北美鹅掌楸DHAR蛋白，通过底物反应测定其功能活性，绘制酶促动力学曲线，并结合qPCR结果，探讨鹅掌楸属种间DHAR基因功能与表达差异。