马尾松EST-SNP标记开发开题报告

1. 研究目的与意义

马尾松(Pinus massoniana）是我国重要的优质针叶用材树种之一，在森林资源发展、松香林产业化及森林生态服务功能中占据重要地位。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。由于SNP分子标记分布广泛、多样性高、数量大，故受到系统进化研究者和分子育种家们的高度重视，并已经成为生命科学研究领域的一个不可或缺的工具。SNP作为优良的分子标记，可以用于研究马尾松不同类型/个体的遗传差异，在马尾松遗传多样性检测、 亲缘关系鉴定和遗传图谱构建等方面发挥着重要的作用。SNP的准确快速鉴定依赖于高效的SNP检测技术，高分辨率熔解曲线分型法(High resolution melting analysis，HRM）可以检测单碱基改变引起的 DNA 双链熔解温度(Tm)值变化，从而可以对样本在SNP上进行基因分型。是一种具有高通量、高灵敏度的SNP分型体系。

本研究基于马尾松转录组数据，筛选生物信息预测得到的潜在SNP位点，通过实时荧光定量PCR技术，以期建立高分辨率熔解曲线分型体系，并加以优化，验证和评估所建立体系的分型效率。

2. 国内外研究现状分析

马尾松在已开发的分子标记中存在缺乏遗传标记的不足，无法满足分子标记辅助育种的需要。现阶段已有利用马尾松转录组数据开发ssr-pcr标记体系(梅利娜等，2017)、依据马尾松转录转座子rt序列建立的马尾松irap-pcr技术体系(崔博文等，2016)。近年snp开启了新的分子标记时代，是继以ssr、issr为代表的第二代分子标记技术基础上发展起来的第三代分子标记技术。snp标记作为目前最具发展潜力的分子标记，因其在基因组中数量多、分布广且在基因分析过程中不需要根据片段大小将dna分带，即可大规模实现自动化，因而更适合于数量庞大的检测分析(唐立群等，2012)。

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，hrm)是2002年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术(gundry et al., 2011）。它是在pcr结束后，根据不同碱基序列构成核苷酸熔解温度不同这一物理性质，在同一容器中直接进行高分辨率熔解，利用饱和染料监控核苷酸的熔解过程，得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的形态变化来判断核苷酸性质的差异(李潇等，2010)。近年来许多研究都利用hrm建立snp位点分型体系。国外已有对疟疾寄生虫基因组snp位点的高分辨率熔解曲线分型体系建立(daniels r et al., 2015)，在植物方面的应用包括通过分析宽皮柑橘的表达序列标签(expressed sequence tag， est）数据鉴别 snp 位点，并用高分辨率熔解曲线分型技术分析宽皮柑橘及柳橙的snp 位点的基因型(吴波等，2012)和采用高分辨率熔解曲线进行不同类型 snp 的基因分型方法建立桃基因紧密连锁的分子标记(鲁振华等，2017)。

目前国内外尚未进行马尾松snp位点的高分辨率熔解曲线分型体系建立的研究，本研究基于马尾松转录组数据，筛选生物信息预测得到的潜在snp位点，期以建立高分辨率熔解曲线分型体系。

3. 研究的基本内容与计划

基于马尾松转录组数据，筛选生物信息预测得到的潜在snp位点，通过实时荧光定量pcr技术，建立高分辨率熔解曲线分型体系，并加以优化，验证和评估所建立体系的分型效率。

1.选取30-35份马尾松转录组样品，筛选snp分型的候选位点；

2.利用oligo 7等软件设计实时荧光定量pcr引物；

4. 研究创新点

1. 目前国内外尚未进行马尾松SNP位点的研究，本研究基于马尾松转录组数据，筛选生物信息预测得到的潜在SNP位点。

2. 本研究根据饱和染料的实时荧光定量PCR的荧光信号检测结果，期以建立高分辨率熔解曲线SNP位点分型的体系并优化体系。国内外尚无利用HRM检测马尾松SNP位点的先例。