凝结芽孢杆菌遗传操作体系建立及外源基因表达开题报告

全文总字数：6363字

1. 研究目的与意义

作为世界经济支柱的石油资源预计在未来数十年将会枯竭，因此，寻找石油资源替代品的研究刻不容缓。目前世界上有很多国家在研究以木质纤维作为石油的替代品，利用生物发酵法制备乙醇等化学物质^[1]。在我国，工业上多以玉米、甘蔗等作为原料进行微生物发酵生产乙醇、乳酸及多元醇类等化学物质。由于此消耗了大量的粮食，极大的影响了粮食的供应，形成与人争粮的局面。为缓解这一局面，充分利用地球资源，寻找可替代的、资源丰富的制备大宗化学品的原料是当前众多研究者关注的热点。木质纤维素广泛存在于林业及农业废弃物中，全球每年的木质纤维素产量约为100亿吨，我国每年可利用的木质纤维素也在7.5亿吨左右。常见木质纤维素包括玉米秸秆、柳枝程、甜菜浆、柑橘皮、木材及造纸废弃物等，是尤为丰富且价格低廉的可再生资源^[2]。

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素以及木质素等组成。其中，纤维素和半纤维素是木质纤维素发酵过程被主要利用的碳源。由于木质素通过共价键和非共价键与纤维素、半纤维素的结合，木质纤维素结构尤其紧密。所以，对木质纤维原料进行发酵前需经过高温高压的预处理，从而达到破坏其紧密结构、提高其可及性目的，以保证发酵的顺利和高效进行。然而，受到预处理较高的反应温度和剧烈条件影响，多种副产物主要包括有机酸、醛类和酚类化合物会随之产生。这类副产物往往对微生物发酵具有抑制效果，极大的限制了微生物发酵水平。

乳酸是世界上最早被利用的三大有机酸之一，其分子中有一个不对称碳原子，因此具有旋光性，分为左旋性乳酸(l-乳酸)和右旋性乳酸(d-乳酸)。作为一种传统的多用途精细化学品，乳酸可作为酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长调节剂、生物可降解性材料和药物等，在化工、医药和食品加工等领域有着广泛的用途。l-乳酸与人体以及其它动物和微生物的高度亲和性，所以其能更好的使用于人类的生产活动中。目前l-乳酸聚合物在生产可降解聚合物的研究方面已成为全球关注的热点，但是，由于乳酸生产成本偏高，使得聚乳酸制造成本居高不下，难以在价格上与传统塑料竞争^[3]。因此，如何高效低成本地生产l-乳酸显得尤为重要。凝结芽孢杆菌是一种近年来受到广泛关注的可利用木糖的工业乳酸菌，可通过同型发酵将葡萄糖及木糖转化为l-乳酸。且凝结芽孢杆菌与其他菌株相比，具有以下优点：发酵过程易控制、可开放式发酵、抗逆性强、产酸能力强以及能耐受较高发酵温度等^[4]。

2. 国内外研究现状分析

2.1木质纤维素发酵的现状及存在问题

2.1.1木质纤维素发酵的现状

目前，工业上多以玉米、甘蔗等可食用生物质作为原料进行微生物发酵生产乙醇、乳酸及多元醇类等化学物质。这些化学物质的大量需求，造成了全球范围内粮食价格的上涨。为了避免未来发生人与化学品共同竞争食用生物质资源的问题，寻找可替代的、资源丰富的原材料是解决问题的关键。木质纤维素广泛存在于林业及农业废弃物中，全球每年的木质纤维素产量约为100亿吨，我国每年可利用的木质纤维素也在7.5亿吨左右^[5]。常见木质纤维素包括玉米秸秆、柳枝、甜菜浆、柑橘皮、木材及造纸废弃物等，是尤为丰富且价格低廉的可再生资源。木质纤维素经糖化后的水解产物中含有葡萄糖、木糖及阿拉伯糖等大量的糖类，这些糖类可以作为微生物发酵生产化学品的碳源。利用可再生木质纤维素生物质资源制备化学品对我国可持续发展具有重要意义。

2.1.2木质纤维素发酵存在的问题

然而，在植物纤维原料高效转化与利用技术中，在微生物发酵木质纤维素的过程中，有以下几个主要问题^[6]：

1：木质纤维素预处理工艺影响可溶性碳源的含量；

3. 研究的基本内容与计划

3.1 研究内容

（1）b.coagulans gkn316在预处理水解液中驯化；

（2）b.coagulans nl01和gkn316抑制物耐受性能比较；

（3）不同抑制物水平下b.coagulans gkn316转录谱差异比较；

4. 研究创新点

本论文基于一株由B.coagulans NL01驯化所得的具有较好能力的抑制物耐受能力的B.coagulans GKN316，将其在预处理水解液中继续驯化，通过比较B.coagulans GKN316和B.coagulans NL01在水解液中发酵时转录谱的差异找出决定耐受抑制物能力的关键基因。建立凝结芽孢杆菌基因的过表达遗传操作体系，并将可能决定抑制物耐受能力的关键基因以基因工程手段在凝结芽孢杆菌中进行过量表达，从而达到提高菌的抑制物耐受能力。