异源表达CepA和TreP合成海藻糖的研究开题报告

1. 研究目的与意义

海藻糖是一种安全天然的非还原性糖，由两个葡萄糖分子以α，α-1，1-糖苷键结合的，且自身稳定性强，广泛存在于细菌，真菌，细胞，昆虫和无脊椎动物中。海藻糖在某些极端环境下如:高温，高压，毒素等情况下维持生物体活性，保护生物体蛋白质等不变性，现今，人们利用海藻糖这一特性，将海藻糖运用于化妆品、食品、药物等一些化学研究产品中，并研究出高效提取海藻糖的方法，打破了传统的提取研究方法，对当时的生物化学界产生了重大的影响。在当今能源缺少的背景下，为满足广大市场对海藻糖的需求，我们不断对其进行研究探索，争取最少的成本，取得最大的利润。

木质纤维原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，并且是制备生物燃料和生物基化学品的首选原料，但由于其结构的顽固性，需要对其进行预处理和酶水解才能得到微生物可以利用的可发酵性糖。其中，我们发现纤维二糖是纤维素酶水解纤维素时的主要产物。由于绝大多数微生物不能直接利用纤维二糖， 需要外源添加β-葡萄糖苷酶进一步水解纤维二糖为葡萄糖，这进一步增加了酶制剂成本。

纤维二糖合成海藻糖的研究较少，因此本文探究以纤维二糖为底物，利用纤维二糖磷酸化酶cepa和海藻糖磷酸化酶trep生成海藻糖的可行性。该途径是由纤维二糖磷酸化酶基因（cepa）催化纤维二糖生产葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸，再由海藻糖磷酸化酶（trep）催化葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸生成海藻糖。

2. 国内外研究现状分析

2.1 海藻糖

2.1.1 海藻糖的性质和机理

海藻糖是由两个D-葡萄糖分子通过α-1，1糖苷键组成。经常以二水化合物存在，是一种安全的非还原二糖且是非常稳定的糖^【1】。最初，海藻糖是由wiggers从黑麦麦角菌中发现，之后发现它不仅存在于低等蕨类植物、藻类、细菌、昆虫及无脊椎动物中，而且更多存在酵母等真菌中，其值可达生物体干重20%以上^【2】。海藻糖是一种对逆境的一种抗逆性产物，又被称作覃糖，分子量378.33^【3】。理论上海藻糖有三种不同的正位异构体，即α，α-海藻糖(又叫蘑菇糖，Mycose)，α，β-海藻糖(新海藻糖，Neotrehalose)，β，β-海藻糖(异海藻糖，Isotrehalose)

图1为α，α型海藻糖构式

海藻糖对某些物种来说是一种衡量抗逆耐受力的尺度，最重要的是海藻糖可以在某些极端环境下如干旱、高温、高压、低温等使得生物体细胞蛋白质、脂肪、核酸等组分不受伤害^[1]。对于这种生物保护机制，国外科学家对其进行了大量的研究并提出了3种假说:水替代假说、玻璃态假说、优先排阻假说^[2]。海藻糖具体拥有以下三种性质：（1）海藻糖安全稳定，因其缺乏游离醛基不具有还原性，不能使斐林试剂变色。它对热和酸碱都具有非常好的稳定性，能与氨基酸、蛋白质共存，不发生美拉德反应。（2）海藻糖具有较高的玻璃化转变温度，它区别于其他的二糖的玻璃化转变温度可达115℃。当海藻糖加入到其它的食品中时，更易形成玻璃态。在水溶液中，海藻糖可以保持玻璃态并形成非吸湿玻璃态，使海藻糖在结晶时保持稳定。（3）低吸湿性是海藻糖的又一特性，即使将海藻糖放置在相对湿度90％以上的地方超过1个月，海藻糖也几乎不会吸湿，有效延长产品的保质期。

2.1.2海藻糖的功能作用

海藻糖具有抗冷冻，抗缩水的生物学功能，更重要的是，海藻糖对生物活性才来哦如菌体及细胞、活性蛋白质、脂质体以及器官等的传递和运输作用七折关键作用和保护作用，因此，海藻糖又被称为生命之糖。其保护作用的独特性在于海藻糖的保护作用是非特异性的，具体来说就是某些微生物在体内存储大量的海藻糖以应对高压、干燥等一些苛刻两条件所带来的威胁，而海藻糖最重要的保护特点在于外源性海藻糖对某些生物体也具有保护作用，也证实了海藻糖的保护作用相较于氨基酸等一些小分子化合物尤为突出^【4-5】。海藻糖还能用于保护生物体内DNA分子免受放射线所带来的损伤^【6】。

海藻糖还具有防止淀粉老化、防止蛋白质变性、抑制菌类物质酸败、保鲜等作用^【3】。

2.2海藻糖的合成途径

海藻糖在不同生物中的合成与代谢的方法也不同，迄今为止，已经报道出5中途径，如OtsA/OtsB（trehalose-6-phosphatesynthase/trehalose-6-phosphate phosphatase）、TreS（trehalose synthase）、TreY/TreZ（maltooligosyl trehalose synthase/maltooligosyl trehalose trehalohydrolase）、TreP（trehalose phosphorylase）和TreT（trehalose glycosyltransferringsynthase）^【6-7】。

图1为不同生物中海藻糖合成与代谢途径

2.2.1 OtsAB途径

该途径是分布最广泛的一条，通常作用于真核生物和原核生物，也是植物中合成海藻糖的唯一途径。此途径包括两步酶促反应，分别为分别由海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-Psynthase,otsA)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-P phosphatase,otsB)催化，两酶分别由OtsA和OtsB编码。在OtsA作用下尿苷二磷酸葡萄糖(trehalose-Psynthase)和葡萄糖-6-磷酸(giucose-6-phosphate,G-6-P)发生反应生成海藻糖-6-磷酸(T-6-P)和尿苷二磷酸(UDP)，再由OtsB酶催化T-6-P反应生成海藻糖和无机磷酸(inorganicphosphate,Pi)。

在我校，有人对此方法进行了探索，并采用P.stutzeriA1501的otsA/otsB基因成功构建了用于生成海藻糖的重组大肠杆菌。通过增加海藻糖合成前体物质的含量和抑制海藻糖的降解进一步提高海藻糖的产量。

2.2.2TreYZ途径

这一途径是将麦芽糖糊精转化为海藻糖，这一方法是日本人于1933年首次发现，也是由两步酶促反应催化。首先在麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,TreY)的催化下发生糖基转移，即将麦芽糖糊精链最后一个还原性葡萄糖的α,α-1,4-转化成α,α-1,1-糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖，其末端含有1个海藻糖集团。接下来在麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,TreZ)的催化下释放一分子海藻糖。该途径不依赖于磷酸化，对于海藻糖生物合成是一个具有应用价值的新途径。

2.2.3TreS途径

这一途径是在海藻糖合酶(trehalosesynthaseTreS)作用下，麦芽糖中的α,α-1,4-糖苷键通过分子内重排异构化成α,α-1,1-糖苷键，形成海藻糖。最初是在脂肪杆菌和水生栖热菌两株菌中发现的，到目前为止只在真细菌中发现该途径。

2.2.4Trep途径

这一方法的酶是海藻糖磷酸化酶(trehalosephosphorylase，TreP)，该酶在无机磷存在的条件下可双向催化海藻糖水解产生葡萄糖-1-磷酸和一分子葡萄糖。但由于这一可逆反应只在体外实验中观测到，还不能确定TreP是否在生物体内参与了海藻糖的合成或者降解

2.2.5TreT途径

该途径是在嗜热古菌(Thermococcuslitoralis)中发现，参与此反应的酶是海藻糖葡萄糖基转移酶(trehaloseglycosyltransferring synthase,TreF)^【8】。该酶催化海藻糖生成ADP-葡萄糖和葡萄糖，也可以将ADP-葡萄糖中的一份子葡萄糖转至葡萄糖的1号位形成海藻糖。在这一途径中，海藻糖葡萄糖基转移酶不仅可以利用ADP-葡萄糖，也可利用UDP-葡萄糖，只是相较于前者，利用率较低。

2.3海藻糖的制备

海藻糖的制备方法主要有从菌体中提取、从发酵液中提取、酶转化法、基因重组法^【9】。

2.3.1酶转化法

该法主要以葡萄糖，麦芽糖，淀粉为底物，通过与海藻糖合成有关酶作用，生成海藻糖，

在这一方法中，以葡萄糖为底物时，由于海藻糖-6-磷酸合酶对底物专一性较强，且需要高能量的UDP-葡萄糖作为底物，成本高，不适用于工业化生产。以麦芽糖为底物，同样面临高耗能的问题，也不适用于工业化生产。而在1994年日本林原化研究所从节秆菌Q36首次发现了低聚麦芽糖基海藻糖合酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶，并利用这两种酶将直链淀粉转化为海藻糖，并且大量运用于工业化生产^【2】。

表1 合成海藻糖相关菌种

据报道，1990年意大利那不勒斯第二大学的Lama等在世界上首次发现硫矿硫化叶菌MT4的细胞匀浆液可将淀粉直接转化为海藻糖^【10】这一发现推动了各国投入人力物力在这方面进行大量研究，争先开拓市场前景。黄英等在E. coli中克隆表达了玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因，使用这种海藻糖合成酶可以实现 85%的转化率，缺点是产品不纯，反应温度低酶易失活。由于磷酸化酶不稳定且需要消耗高能物质尿苷二磷酸(UDP)或高浓度磷酸盐等，不适用于大规模的工业化生产，仅1998年日本有过商业化生产的报道^【11】。目前双酶法以直链淀粉为底物，通过两种酶的反复反应最终形成海藻糖。2000年，南宁中诺生物工程有限责任公司成功开发出酶法转化木薯淀粉生产海藻糖的工艺，使我国成为世界上第二个酶法工业化生产海藻糖的国家。工业上常用脱支酶进行淀粉初步水解为双酶法提供底物。在该反应中糖基转移酶催化麦芽寡糖向糖基化海藻糖转化，产生具有糖苷键的葡糖基海藻糖，淀粉酶催化葡糖基海藻糖水解为海藻糖，转化率高达80%^【12】。

2.3.2基因重组法

即利用基因工程技术将海藻糖合成酶基因导入植物或微生物中，从而利用工程菌株或具有生产海藻糖能力的转基因植物生产海藻糖。利用基因重组法通过在E.coli中过表达海藻糖合成的酶，结合全细胞催化合成海藻糖，利用E. coli细胞的代谢将底物葡萄糖完全消耗，从而获得纯度较高的海藻糖产品，是一个潜在的获得海藻糖高纯度产品的方法。L-Padilla等人在谷氨酸帮杆菌中过表达来源于E.coli的海藻糖合成酶OtsBA基因的同时，过表达E. coli的UDP-葡萄糖磯酸化酶（galU），使得海藻糖的产量提高了6倍。目前比较成熟的基因工程技术是美国Calgene公司与英国Quadrant公司，两家公司联合研究利用大肠杆菌基因工程发酵生产海藻糖。近年来，植物基因重组技术得到了广泛的应用，我国张树珍等从担子菌灰树花中克隆海藻糖合酶基因并导入甘蔗，从而使甘蔗具有更长的保质期且风味较之前更好^【13】。美国Calgene公司把一组能够将葡萄糖转化成海藻糖的基因通过间接的方法导入到富含葡萄糖的植物中，得到重组植物可以积累海藻糖。荷兰的Mogen与Vander公司将大肠杆菌合成海藻糖的基因otsA和otsB导入马铃薯、甜菜等农作物中提高其积累海藻糖的能力，同时提高了植物的耐寒抗旱能力^【12】。现代工业生产中也常常使用基因工程法与酶转化法结合。利用基因工程技术生产海藻糖具有很大的优势。目前发现的能产海藻糖的微生物有很多，同时也发现了不同的生物合成途径和相关的酶。

2.3.3从菌种中提取

又可称为生物提取法，由于霉菌、酵母菌、乳酸菌和一些真菌都含有海藻糖，因此我们可以选取含量高者为提取源提取海藻糖。其一般流程为活性干酵母-提取-冷却-离心-上清液浓缩去醇-去离子和蛋白-浓缩-结晶-过滤-干燥-成品。早期商品化的海藻糖是从酵母中提取的，先培养酵母菌株到对数生长期，再调控酵母菌培养条件，使酵母细胞处于饥饿状态（降低碳源、氮源）或胁迫环境(高温、高渗透压、干燥和冷冻)。体内海藻糖的含量明显增加，可达细胞干重的20%，然后利用乙醇等有机溶剂从酵母菌中抽提纯化海藻糖^[15-16]，但是从酵母中提取海藻糖，其成本较高，可供应量较少，故而限制了该技术的发展^【9】。

2.3.4从发酵液中提取

又可为微生物发酵法，即在一定的基质上培养微生物，并通过该为生物发酵生产海藻糖。发酵法主要步骤是通过采用诱变、细胞融合或基因重组等方法培育出高产海藻糖的菌株，采用高浓度的培养基及高渗发酵，最后可得到含海藻糖高的产物。目前可利用的微生物主要包括酵母、革兰氏阳性菌，特别是微球菌属^【17】。但是，此方法存在一个致命的缺点，就是转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制困难^【19】。

2.4海藻糖的应用

海藻糖具有稳定生物膜，蛋白质等大分子以及抗逆保鲜作用

2.41用于生物产品的干燥与保存

海藻糖可用于保存药品和研究用生物产品,如酶、疫苗、菌苗、病毒、血液制品、单克隆抗体、载药脂质体、外科手术所需皮肤、器官及干PCR试剂盒等。大部分生物产品易失活，须低温存放 。

国外学者对海藻糖进行了深刻的研究。董桥等证明蛋白质等大分子在海藻糖的保护作用下,脂质体脱水后保持干燥状态且保持完整的结构和功能,且干态脂质体水化时内含物保存率达80%以上。葛宇等研究了在冷藏、冷冻、真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥和室温下海藻糖对保加利亚乳杆菌存活率和产酸率的影响,结果表明,海藻糖具有很好的抗冷冻、抗脱水效果^【2】。

2.4.2在化妆品中的应用

海藻糖本身具有保湿、防晒、防紫外线等功能，因此常被用于化妆品的制作中，如洗面奶，作为保湿剂、唇膏、防晒霜等。日本林原生化研究所发现海藻糖对老年人的体臭具有抑制作用，并且准备开始研发一款具有此功能的化妆品。

2.5纤维二糖

纤维二糖的结构单元是纤维素晶胞，也是纤维素酶解的主要产物。纤维二糖具有两面性，在较低浓度下(＜10mmol/L)可直接诱导外切纤维素酶的合成，但当＞20mmol/L时则会导致阻碍作用。在促进纤维素酶的合成过程中，虽然纤维二糖的诱导效率低，但因其具有普遍性且又容易得到，因此可采用流加的方式促进纤维素酶的合成^[14]。而纤维素二糖磷酸化酶具有转糖基活性，通常被用来合成一些重要的生理功能的糖或者利用他们的改性。而这两方面存在两个主要问题:一是微生物具有较差的转移酶活性，二是微生物糖基转移酶产量较低。而第一个问题我们通常采用适当的热稳定性酶源，第二个则将与纤维素二糖磷酸化酶蛋白合成的有关基因克隆到E coli后扩大再培养^[7]。

纤维二糖也可以作为良好的碳源来支持培养基内菌种的生长，并且与葡萄糖相当。在培养松茸的菌丝生长过程中发现，纤维二糖不是一种直接由植物提供的简单碳源，却可以土壤有机体的纤维素分解酶从复杂的碳源分解出来，T.matsutake还显示了对硝基苯-PD-乳吡喃糖苷酶对纤维素酶的一些活性^【18】。

2.5以纤维二塘为底物合成海藻糖

目前该方法国内外研究较少。该方法需要两种酶诱导，为CepA和Trep。该途径以纤维二糖为底物，在CepA的作用下，将纤维二糖催化生产葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸，再由海藻糖磷酸化酶（TreP）催化葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸生成海藻糖。这一途径有一明显的优点，就是成本低效益高。

3. 研究的基本内容与计划

3.1研究内容

1、纤维二糖磷酸化酶cepa及海藻糖磷酸化酶trep的纯化。

诱导表达重组大肠杆菌bl21（petduet-cepa）、bl21（petduet-trep）：通过镍柱纯化得到纯化蛋白，进行目的蛋白的sds-page分析。

4. 研究创新点

本次研究通过重组大肠杆菌全细胞催化合成海藻糖。我们首次提出了纤维二糖磷酸化酶（CepA）和海藻糖磷酸化酶(TreP)两种酶共同催化纤维二糖生成海藻糖。首先对大肠杆菌BL21（pETDuet-cepA）和BL21（pRSFDuet-trep）进行诱导表达并进行目的蛋白的SDS-PAGE分析，确保目的蛋白的表达后，以纤维二糖为底物，联合纤维二糖磷酸化酶CepA及海藻糖磷酸化酶TreP合成海藻糖。