饮用水微生物群:一个全面的时空研究，以监测巴黎供水系统的水质外文翻译资料

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水的研究

Yoann Perrin A，B，Didier Bouchon A，Vincent Delafont A，Laurent Moulin B，*，1，YNN HECHARD A，**，1

（文章信息：文章历史： 2018年6月18日收到，2018年10月25日收到修订后的表格，2018年11月5日发布，2018年11月12日在线发布）

关键词：微生物群落饮用水细菌生态学16S

摘要

饮用水配水系统微生物水质是关系人类健康的首要问题。近十年来，高通量测序在描述水系微生物多样性方面得到了越来越多的关注。然而，这种方法在大型饮用水分配系统和较长时间内描述很少有研究。为了填补这一空白，并通过时间和空间观察水系微生物区系的潜在细微变化，我们打算采用16S rRNA基因高通量测序方法，在一年内表征巴黎的饮用水配水系统的细菌群落。在这项研究中，巴黎配水网络由4个不同的饮用水配水系统组成，在31个地点进行抽样调查，每个月进行一次，为期一年。此项抽样活动是迄今为止最大的描述关键的时空和理化参数研究的重要性的368项活动之一。总的来说，在巴黎网络中发现了1321个分类单元，尽管在所有样本中只有15个分类单元的相对丰度较高(gt; 1%)。在其中，疟原虫属和丝孢菌属这两类占优势地位。空间参数和物理化学参数对这4个饮用水配水系统中细菌的多样化没有显著影响。然而，在一年的时间内(时间参数)，可能与之前的洪水事件有关，我们能够观察到饮用水配水系统微生物群的扰动，细菌多样性略有变化。16S rRNA基因扩增物的高通量测序与栽培技术的比较表明，通过栽培仅恢复1.8%的细菌多样性。高通量测序通过描述整个多样性和检测细菌群落中的微小波动，使监测饮用水配水系统比传统方法更准确成为可能。这种方法将进一步用于监督饮用水网络，跟踪由内部事件(如特殊治理)或外部事件(如洪水)引起的任何扰动。

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1.介绍

水质对人类健康至关重要，因此饮用水受到精心保护、监测和管理（Proctor和Hammes，2015年）。饮用水配水系统的水质取决于不同的参数，包括微生物指标。根据世卫组织的建议和国家规定（世界卫生组织，2017年），化学成分也由若干参数进行监测。一个多世纪以来，对饮用水微生物质量的评价主要是通过测定可培养细菌，即异养平板计数（hpc）（Frankland和Frankland，1894年）和粪便指标的检测（Anderson等人，2005年）。然而,这些估计不代表一个可靠的代理评估饮用水中微生物多样性的分布。i）异养平板计数是在水网中衡量水降解的指标，但是仅有微小部分的细菌可以用这个方式。i i）粪便指标中，大肠杆菌和肠球菌,是水处理的效果监测,和检测粪便病原体（Saxena等人，2015年）。根据定义，它们与其他病原体无关，如安装管道时伺机进入的病原体（Ashbolt，2015a）。饮用水处理厂或供水过程中可能遇到的内生细菌问题，可导致诸如铜绿假单胞菌和嗜肺军团菌等内生细菌病原体的扩散等（Ashbolt，2015b；Lu等人，2015）。在饮用水设施中，细菌的过度生长可能会在分布过程中导致技术并发症，如由于生物膜的发育或水质的退化而导致管道污染或生物腐蚀（Allion等人，2011年；Nawrocki等人，2010年）。在生产点和自来水之间细菌群落变化较低的饮用水可以被认为是生物稳定的（Prest等人，2016a）。因此，沿着饮用水网络的微生物群落的丰度和组成，是能够跨越时间和空间对饮用水微生物组成进行精细描述的关键参数。到目前为止，这类分析还没有常规地进行，但是未来可能会开发新的工具来支持这种方法（Liu等人，2018年）。

目前，描述整个微生物多样性的微生物组可以通过使用高通量测序进行特征分析，从而对这种多样性进行独立于培养的分析（Caporaso等人，2011年；Goodrich等人，2014年）。有几项研究描述了饮用水的微生物组（Ji等人，2015年；Pinto等人，2014年、2012年；Roeselers等人，2015年；Shaw等人，2015年；Zhang等人，2017年）。最近的一篇综述指出高通量测序在评估微生物水质方面的有效性（Tan等人，2015年），例如可以检测粪便指示菌、病原体的任何基因组，跟踪抗生素耐药性基因，预测污染物的生物降解。这些研究表明，细菌多样性可能受到原水来源的影响（Gomez-Alvarez等人，2015年；Ji等人，2015年），各处理步骤（Lin等人，2014年；Pinto等人，2012年），氯化类型(如有) （Hwang等人，2012年；Stanish等人，2016年），管道材料（Ji等人，2015年；Ren等人，2015年），建筑管道中促进滋生的生物膜内的停滞（Ji等人，2015；Ling等人，2018），或季节性变化等（Hwang等人，2012；Pinto等人，2014；Potgieter等人，2018；Prest等人，2016b；Roeselers等人，2015）。虽然这些研究对定义和理解饮用水微生物群落有很大帮助，但大多数研究是在有限的空间(如建筑)或时间尺度(如一个月取样)下进行的，其中一些研究是在实验室条件下使用模拟管道系统进行的。因此，关于时空微生物多样性的知识仍然匮乏，特别是在大城市的背景下（Pinto等人，2014年；Potgieter等人，2018年；Roeselers等人，2015年）。

为了填补这一空白，我们在研究中对法国巴黎的四个不同饮用水配水系统进行了为期一年的大规模抽样调查。采用16S rRNA基因高通量测序技术对样品中的细菌群落进行了表征和监测。我们的目的是了解哪些因素可以影响微生物组，例如水的来源(地下水或地表水)、时间和所选的理化参数，并将微生物的变化与异养平板计数提供的所需数据进行比较。

2.材料和方法

2.1网络特性和样本收集

巴黎市的饮用水由4个饮用水配水系统供应。它们每一个都由一个短期储存净化饮用水的水库和一个由附属水库提供的配水管网组成（图1）。巴黎的水分配网很复杂，这一因素极大地阻碍了对居住时间和水库管道长度的估计。该管网的总尺寸估计为1800km的铸铁管。采样点与水库之间的直接距离估算如表A1所示，它们在1至16km之间。平均而言，饮用水在管道中的停留时间约为24小时。圣克劳德和蒙特苏里饮用水配水系统由巴黎周边的多个水源提供地下水，曼尼蒙特的饮用水配水系统由马恩河地表水供水，莱斯罗斯的饮用水配水系统由塞纳河提供地下水和地表水混合供水。地下水通过活性炭吸附和活性炭过滤处理。地表水经过一系列物理或生物过滤（预臭氧化、倾析、预过滤和砂过滤）和臭氧化阶段，然后在颗粒活性炭过滤和紫外线消毒之前进行臭氧化阶段再进行氯化和分配。

对于四个饮用水配水系统中的每一个，我们每月收集不同地点的水库和配水管网的数据。每个饮用水配水系统每月收集一个与水库对应的样本。每月在配水管网的管道上对马恩河、莱斯罗斯和塞纳河等7个地点和曼尼蒙特的饮用水配水系统等6个地点对供水管道进行采样（图1；表A.1）。

由于技术问题，两个月后停止了对曼尼蒙特的饮用水配水系统第七点的取样。因此其不包括在分析中。为了最大限度地减少私人网络卡顿的影响（Pepper等人，2004年），样本的所有数据不能直接集中到收集网的最后一个点上。每个月，从一个采样点进行的采样可能会有一到两天的变化。总的来说，从2016年3月到2017年2月，一共采集了368份1L水样，在保持4℃的温度下运至实验室。实验室中，对样品在24小时内进行处理，并根据欧洲法规进行监测，记录物理化学参数（温度、pH、总氯、电导率、硝酸盐和磷酸盐浓度）。这些参数是由巴黎大学认可的实验室使用标准化程序现场测量的（分别为ph值的nf t90-008、nf-en-iso 7393-2和nf-en 27888）。每个样品的所有信息见附录B。

图1. 巴黎市四个饮用水配水系统和所有采样点的分布地图

拉哈斯玫瑰,梅尼蒙当,蒙苏里公园圣克卢供水管网分布 拉哈斯玫瑰 , 梅尼蒙当 , 蒙苏里公园， 圣克卢 水库分布。 配水管网和相关水库形成了一个饮用水配水系统。

2.2 DNA纯化和扩增子测序

用0.2 mm醋酸纤维素膜过滤1升的水样。按照制造商的描述，使用动力水 DNA分离试剂盒（Mo Bio Laboratories，Inc.，Carlsbad，CA）从膜中提取总DNA。从总DNA中，利用引物U341F (5^- cctacgggrsgcagcag -3^) （Baker等人，2003年）和巴克特_805R (5^-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3^) （Herlemann等人，2011年）扩增了细菌16S rRNA基因可变区域V3-V4对应的464-bp片段。选择这些引物是因为它们对SILVA数据库释放128中16S rRNA基因序列的高覆盖度。U341F-巴克特_805R引物对分别检测到84.0%和49.3%的细菌和古菌序列均无错配。PCR和测序工作由法国巴黎埃皮涅尔酿酒厂研究所的基因型分型和测序平台分包（https://icm institut e.org/fr/）。简单地说，扩增子使用FastStartTM PCR主工具包(罗氏生命科学)扩增(35个周期)，每个末端有一个20 bp的适配器。利用FastStartTM高保真度PCR系统试剂盒(罗氏生命科学)，在第二个PCR步骤中加入索引和处理(P5和P7)序列。使用伊丽莎白米塞克平台使用2x250 bp对端对扩增子库进行测序(2x250 bp对端)。测序结束后，自动进行多路复用。

2.3 序列数据处理

序列分析采用QIIME (微观生态学定量研究)管道1.9.0版（http://qiime.org/）（Caporaso等人，2010b）。在序列数据处理之前，将每个适配器的每一侧的20bp移除。总体质量得分低于30分的序列和3个以上的歧义碱基被丢弃。使用USEARCH 6.1（Edgar，2010年）鉴定嵌合体并丢弃。利用UCLUST（Edgar，2010年）将剩余的信息以97%的相似性阈值聚类为操作分类单元。在随后的分析中，没有考虑单例，即由少于2个序列表示的操作分类单元。选取每个操作分类单元对应最丰富序列的代表性序列。序列使用Pynast v1.2.2进行对齐（Caporaso等人，2010a）。分类法被分配到属级别，使用UCLUST共识分类法分配器和SILVA数据库，第128版（Quast等人，2013年）。伊丽莎白米塞克扩增子测序使我们获得47 277 387 V3-V4 16S rRNA基因序列。对嵌合序列和单例进行高质量的过滤和去除后，获得22 837 823条高质量的信息，并在141 701 操作分类单元中进行聚类，相似度截断率为97%。

2.4空白样品

取7个空白样品，对7个不接触水的醋酸纤维素膜进行提取和测序。比较空白和样品进行使用主坐标分析,基于加权UniFrac距离,如下详细(图3)。此外,德康塔姆河包被用来识别和消除污与空白样品后序列数据处理（Davis等人，2017年）。因此，删除了381107序列对应的5315个UniFrac，最终的数据集由136 386个操作分类单元组成。平均59 725plusmn;2155(平均plusmn;权重)为每个样本序列了。

2.5样本统计分析

QIIME生成的最终BIOM文件导入R版本3.3.3（R核心团队，2017年） 。样本间的大序列号变异会影响相对丰度估计和后续的排序分析（Goodrich等人，2014年；Weiss等人，2017年）。为了防止这种偏差，我们使用元基因多态性包对最终的OTU表进行归一化（Paulson等人，2013），使用的方法是将每个样本的计数按样本和进行缩放。之后，使用植物化石软件包对微生物群落进行了探索（McMurdie和Holmes，2013年）。使用置换多元方差分析（Permanova）（Anderson，2001年），使用素食包年龄（Oksanen等人，2017年）进行999个置换和beta;分散性分析（beta;分散功能），比较DWD、位置或时间上的微生物多样性。PCOA采用PhyleSeq软件包（McMurdie和Holmes，2013年），使用定量（Bray-Curtis和加权unifrac）或定性成分异议（Jaccard和未加权unifrac）（表A.2）。每对皮尔逊相关性被用来评估物理化学参数和最丰富的分类单元或细菌多样性之间的关系。皮埃洛均匀度采用菌群包计算（Lahti等人，2017）。

2.6 异养平皿计数

每个样品按照NF EN ISO 6222进行异养培养。1毫升的饮用水是生长在R2A琼脂板通常用于监测可培养的细菌从水样,在22℃放置3天或者在36℃环境下放置2天.鉴定细菌菌落是由基质辅助激光解吸飞行时间质范围——测量 (MALDI-TOF MS)。将细菌菌落转移到不锈钢靶上，每个靶点加1ml的70%甲酸，方便蛋白提取。最后，每个斑点上覆盖1ml的HCCA基质(50%乙腈/2.5%三氟乙酸中的a-氰基-4-羟基肉桂酸)。光谱采集使用Microflex的LT的MALDI-TOF质谱结合生物泰伯软件和相关数据库进行。该系统使用细菌测试标准进行校准。

2.7 16S rDNA基因的定量PCR

采用SYBR Green检测系统对细菌16S rRNA基因进行PCR定量分析。采用515F (5^- gtachvgggtatc - TAATCC-3^)和巴克特-805R (5^- gactachvgggtatc - TAATCC-3^) 引物组扩增细菌16S rRNA基因

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