一种基于LAMP技术快速检测抗甲基硫菌灵的草坪币斑病菌突变位点方法的建立与应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1研究意义币斑病菌是常见的草坪病害病原物，几乎可以侵染所有的冷季型和暖季型草坪草，对草坪景观及其生态、经济效益均造成破坏。

近年来，币斑病菌对市面主流化学药剂所产生的抗性突变逐渐增多，并且常为点突变引起的抗性。

本课题设计环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，lamp）体系，有针对性地快速检测币斑病菌对甲基硫菌灵产生的抗药性点突变，将对防治草坪病害化学药剂的选择进行有效指导，提高草坪管理工作效率的同时，减少草坪病害病原真菌抗药性引起的损失。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标利用lamp技术，设计针对币斑病菌对甲基硫菌灵抗药性点突变的lamp反应体系，达到能在田间应用lamp技术快速检测币斑病菌抗甲基硫菌灵突变体的目标。

2.2研究内容（1）将前期实验中获得的典型币斑病菌对甲基硫菌灵的抗性菌株与敏感菌株进行dna序列分析，比对获得抗性突变体的抗性突变位点，根据lamp技术的原理，设计能使抗性菌株dna在扩增过程中发生碱基错配的引物，根据是否有扩增的产物，达到区分抗性菌株与敏感菌株的目的。

（2）利用已报道的lamp体系，将其中的引物替换为所设计的引物，进行扩增反应。

3. 研究的方法与方案

4. 研究创新点

4.特色或创新之处目前，在检测基因突变方面，常见的方法有限制性片段长度多态性聚合酶链反应（pcr-restriction fragment length polymorphism，pcr-rflp）、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific pcr，as-pcr）、四引物扩增受阻突变体系pcr （tetra-primer arms pcr）等，但这些常见方法往往需要高浓度的dna作为底物，并且需要复杂的热循环反应过程、特定的方式检测试验结果，灵敏度低、反应条件要求高、成本高。

而lamp技术在直接裂解的菌液中也可以检测到dna，稳定的热源即可保证反应的进行，同时反应的副产物焦磷酸镁为肉眼可见的白色沉淀，加入hnb等染色剂染色后，可以快速清晰地判断结果。

因此，lamp技术灵敏度高、试验条件要求低、结果清晰易判断的特色，如果能广泛地应用于币斑病菌抗药性的快速检测中，将更加高效地指导杀菌剂的田间使用管理。

5. 研究计划与进展

5.研究计划及预期进展：2017年9月-2018年1月：币斑病菌的活化与dna的提取，为后续工作准备基本材料。

2018年2月-2018年4月：阅读文献，选择一定的lamp体系，在设计的多条引物中筛选出特异性引物。

2018年4月-2018年5月：利用筛选出的特异性引物，对lamp体系进行调整，获得效果最佳的lamp体系，整理并形成论文。