1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）
动物早期囊胚由外层的滋养层细胞以及里层的内细胞团细胞组成，它们在胚胎后期发育过程中各自承担着重要作用。通过对体外生产的囊胚的滋养层细胞(te)和内细胞团细胞(icm)进行差异染色，并统计各自细胞数及相关比例，可直观判断囊胚质量的优劣。近年来，此种方法已在多种动物的胚胎质量鉴定中广泛应用[2]。handyside等[3]根据tcm和te细胞在形态结构和免疫学方面的差异，借助抗体结合荧光染料成功地对这2种细胞进行了染色。rabindranath等[4]借助钙离子载体成功地对小鼠、猪和牛的囊胚进行了双重染色。thouas等[5]各染色程序进一步简单化，利用triton x-100代替钙离子载体，实现了对囊胚的双重染色，缩短了染色时间，降低了染色成本。李瑞岐等[6]用囊胚双重染色方法检验了果糖对牛胚胎早期发育效果的影响。李瑞岐等[7]利用hoechst33342/pi双染结合triton x-100处理的方法获得了能够快速对小鼠囊胚进行双重染色，可以作为改进体外受精实验室质控的方法。芦天罡等[8]利用hoechst33342/pi双染结合抗羊脾细胞抗血，清豚鼠补体的方法找到一种简洁有效的小鼠胚胎质量鉴别参考方法。刘帅等[9]发明了一种试剂器材简单，操作简单，计数准确，降低囊胚消耗，对猪囊胚进行简易荧光计数的方法。
本实验分别通过hoechst 33342、pi、以及hoechst 33342/pi 双染等三种方法对孤雌激活后体外培养第6天得到的猪囊胚进行染色，并统计总细胞数、内细胞团细胞数，计算先关比例以评估囊胚质量。同时观察并比较这些方法在反应囊胚质量的准确性、直观性等方面的异同，以期为更经济、高效、准确地评估猪体外生产囊胚的质量提供参考。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题
研究的目标、内容
本实验综合hoechst 33342、pi、以及hoechst 33342/pi双染等三种常见的囊胚质量染色鉴定方法，对孤雌激活后体外培养第6天得到的猪囊胚进行染色，并统计猪囊胚期的总细胞数、内细胞团细胞数以及内细胞团细胞数与总细胞数的比例来反映胚胎质量，同时综合比较各种染色方法的优劣，为改进并简化以往的染色方式以及更经济、高效、准确地评估胚胎质量，提供参考依据。
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1.囊胚的染色方法 1.1 Hoechst 33342染色 Hoechst 33342是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在激发光作用下发出兰色荧光。正常情况下，荧光染料 Hoechst 33342 只有少量能透过细胞膜进入细胞，使其染上低蓝色。但是当细胞发生凋亡时，它的细胞膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高。此外，凋亡细胞的染色体DNA 的结构发生了改变，从而使该染料能更有效地与DNA 结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。 1.2 PI染色 碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染[4]。 1.3荧光Hoechst 33342 /PI双染 将囊胚放入0.5% pronase中去透明带后用 PVA-TL-HEPES 或者PBS-PVA洗涤5 min 3遍，再放入 1：5 稀释的兔抗猪全血清中作用1 h 取出，放入 PVA-TL-HEPES 或者PBS-PVA中洗涤5 min3 遍，然后转入含 10 gml-1 PI 和10gml-1 Hoechst33342的1：10 稀释的豚鼠补体液滴内作用1 h，接下来再用PVA-TL-HEPES 或者PBS-PVA中洗涤 3遍。最后，将上述胚胎转移到干净的载玻片上的甘油液滴内，尽量少带原液，以胚胎所在处为中心，在盖玻片大小范围内的四角做 4 个由凡士林/石蜡油组成的柱，盖上盖玻片，再轻轻压盖玻片，最后用指甲油封片。然后在 Nikon E800 荧光显微镜下利用 UV激发，照相，记录，计数。ICM 呈蓝色，TE呈粉红色到红色。 2.胚胎的质量鉴定 荧光染色后的胚胎在荧光显微镜下观察, 胚胎移到载玻片上时应尽量少带入液体或吸掉大部分液体, 利用液体的压力使胚胎铺展在载玻片上, 使细胞球扩散避免重叠, 便于观察。分别对不同发育时期的囊胚染色后滋养层和内细胞团的细胞数进行计数，计算不同发育时期囊胚的内细胞团和滋养层细胞的比例，从而鉴定胚胎质量。 实验方案 1.从猪卵巢上2mm-6mm卵泡中采集致密且至少2层卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合物（COCs），体外成熟42-44h； 2.挑选排出极体的卵进行孤雌激活（D0），于体外培养第六天收集囊胚； 3.分别对胚胎进行Hoechst33342染色、PI染色和Hoechst33342/PI双重染色，并对胚胎中滋养层和内细胞团细胞进行计数，并统计囊胚内细胞团和滋养层细胞的比例，评定猪囊胚的质量，同时进而比较三种染色方法的优劣。 可行性分析 本实验所用到的试验方法及实验材料都较易获得，并且染色方法都已相当成熟，故实验可操作性强。 |
4. 研究创新点
特色或创新之处
随着不断的探索和研究各种动物囊胚染色方法得到了进一步的发展，不同染料的差异染色可以让实验结果更为直观，准确，胚胎质量鉴定更加方便，由此尝试建立一种高效的针对猪胚胎的双重荧光染色方法。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2015年5月--2015年6月：阅读相关资料（文献和书籍）
2015年6月--2016年3月：购买试验与耗材，进行样品分析和试验分析
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