用于功能蛋白递送的合成蛋白模拟物外文翻译资料

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用于功能蛋白递送的合成蛋白模拟物

A. Özgül Tezgel, dagger; Paejonette Jacobs, Dagger; Coralie M. Backlund, dagger; Janice C. Telfer,* ,Dagger;,sect;and Gregory N. Tew

高分子科学与工程系、分子与细胞生物学程序，兽医和动物科学，麻州大学，Amherst，马萨诸塞州01003，美国

摘要：由于蛋白质不能有效穿过细胞质膜的事实，蛋白质作为生物工具和治疗剂的使用受到限制。在这里，我们报告一类新型基于通过开环易位聚合（ROMP）合成蛋白转导结构域模拟物（PTDMs）的转运蛋白分子。这里报道的PTDM具体受到已知通过肽和货物之间的非共价相互作用将功能性蛋白质递送到细胞中的亲体肽的驱使。与如TAT，穿膜肽和R9这样的肽相比，其通常需要与其货物共价融合。使用易于调节的合成的ROMP平台，通过将EGFP递送到Jurkat T细胞中确立具有阳离子胍基的较长疏水链段的重要性。这些蛋白转运蛋白中最有效的用于递送具有〜80％敲低效率的功能性Cre重组酶到难以转染的人类T细胞中。此外，C末端缺失形式的转录因子Runx1（Runx1.d190）被递送到原代鼠脾细胞中，产生c-Myc mRNA生产的2倍增长，表现出该平台将生物活性蛋白质递送难以转染细胞类型的多功能性。

介绍

蛋白质作为基础研究试剂具有巨大的价值，甚至作为人类治疗剂具有更大的潜力。 1然而，这种潜力是有限的，因为许多具有有趣的细胞间功能的蛋白质通过细胞膜具有差的渗透性或转导。这阻止了进入细胞内部目标（细胞质和细胞核）因此，主要的兴趣还在于开发新的，更有效的能够将蛋白递送到哺乳动物细胞中的工具。一般来说，蛋白质传递有四种主要方法：（i）物理方法，如电穿孔2,3和显微注射; 4,5（ii）基于病毒的载体; 6（iii）共价连接的递送剂，最显着的是称为细胞穿透肽或蛋白质转导结构域（PTD）的一类分子; 7-10和（iv）蛋白质和递送系统之间的非共价组装。最可能研究的非共价递送系统也许是两亲性肽，如Pep-1,16，但其他的也存在，如基于脂质的纳米粒子。

尽管取得了一些成功，细胞内的传递依然是一个重大挑战。更有效的PTD的发展将大大增加可及的细胞内靶标的范围，导致蛋白质试剂和治疗剂数量的巨大增加。许多研究已经显示出基于肽的PTD，如TAT，寡精氨酸，而穿透素可以仅在与货物共价融合时才能转导蛋白质。 7-9最近，在多个并行研究中，超电荷GFP显示出比小TTD，寡精氨酸和穿透素等小的PTD有效。然而，共价融合需要将每种感兴趣的蛋白质作为独特的分子生产，限制其可用性和用途。为了克服这个局限，对非共价平台的关注已经增加。包括Pep-1和Wr-T在内的能够实现非共价蛋白递送两亲肽或嵌段型肽已经被开发出。Pep-1是第一个也是最广泛研究的肽;它由主要由色氨酸（W）组成的疏水结构域组成，据报道其16亲水结构域来自SV40大T抗原的核定位序列（NLS），含有6个氨基酸（KKKRKV）。尽管这些肽能有效地递送许多蛋白质，包括在体内，但据我们所知，没有文献报告显示，折叠的功能活跃的蛋白质递送进入重要人类T细胞系悬浮液和具有高效力的原代细胞。

图1.筛选PTDM以确定其蛋白质递送效率。 （a）PTDM的化学结构。 （b）流式细胞仪分析，显示EGFP通过PTDM-1（红色曲线）或Pep-1（绿色曲线）以40：1转运蛋白与货物的摩尔比递送到Jurkat T细胞。 （c）用不同的PTDM / EGFP复合物在两个不同的摩尔比20和40处理后EGFP阳性细胞的百分比。PTDM-1与PTDM-IG1比较* p lt;0.05。 用PTDM / EGFP或Pep 1 / EGFP复合物处理Jurkat T细胞4小时，并用含有肝素（20U / L）的PBS洗涤三次后通过流式细胞仪分析以去除细胞表面结合分子。 EGFP浓度：60nM; PTDM：1.2mu;M（摩尔比20）和2.4mu;M（摩尔比40）。 值和误差条代表三个独立实验的平均值plusmn;SD。

受PTDs更具体地通过两亲性递送肽启发，这里报道了一系列蛋白转导结构域模拟物（PTDM），其能够高效地递送功能性蛋白质进入难以转染类型的细胞中。这些PTDM含有连接到由苯丙氨酸样功能化单体组成的疏水结构域的富含胍的结构域。第一个PTDM含有相同长度的结构域，并将EGFP比Pep-1更有效地递送到Jurkat T细胞;将胍官能团改为胺，苯基变为吲哚环降低递送效率。疏水结构域的长度也很重要，显示随着结构域长度的增加，蛋白质的递送也增加。在能量耗尽条件（ATP耗尽的培养基或4℃）下，蛋白质递送效率没有受到很大程度的影响，表明大量的分泌物包含能量不依赖的途径，或直接易位穿过膜。进行与Cre重组酶的研究以检查功能酶的递送。这允许直接比较非共价PTDM / Cre之间的递送效率

复合物和市售的TAT-Cre融合蛋白。非共价PTDM / Cre系统在100nM Cre下4倍更高效。最后，我们的基于PTDM的系统成功地用于将原生的C末端缺失形式的转录因子Runx1（Runx1.dl90）递送到原代鼠脾细胞中。这允许非共价PTDM / Cre复合物和市售的TAT-Cre融合蛋白递送效率的直接比较。非共价PTDM / Cre系统在100nM Cre下4倍更高效。最后，我们的基于PTDM的系统成功地用于将原生的C末端缺失形式的转录因子Runx1（Runx1.dl90）递送到原代鼠脾细胞中。在这里报道的新的PTDM在蛋白质递送方面显示出比TAT融合蛋白（共价方法）和Pep-1 /蛋白复合物（非共价方法）更有效表明使用仿生设计原理开发新的转导平台的重要性。

材料与方法

PTDM的合成。 如前所述合成Boc-保护的胍和胺官能化的氧代降冰片烯单体和吲哚和苄基官能化的氧代降冰片烯单体（详见参考信息）。 PTDM是以不同嵌段长度的胍和苄基官能化单体的共聚物，由Grubb的第三代催化剂聚合（详见参考信息）。 在本文中，我们将疏水部分称为苯基而不是苄基，以将其与苯丙氨酸的相似性相似。 PTDM通过具有非常窄的多分散性指数（PDIs;表S1）的NMR和凝胶渗透色谱（GPC）表征。

细胞培养条件。 将Jurkat T细胞（E6.1克隆，ATCC）和Cre / LoxP报告人类T细胞系（ABP-RP-CGFPLoxT，购自Allele Biotechnology）在完全RPMI（补充有10％胎牛的RPMI 1640 glutamax I 血清（FBS），HEPES，非必需氨基酸，丙酮酸钠，青霉素/链霉素）。

PTDM / EGFP转运到Jurkat T细胞。 将60nM EGFP（购自BioVision）和不同浓度（0.3-2.4mu;M）的PTDM在200mu;LPBS中混合，并在室温下孵育30分钟以形成复合物。 Jurkat T细胞计数并以400000个细胞/孔将其铺在12孔板中，在800mu;L含有10％FBS的无血清RPMI 1640或RPMI 1640培养基中。将复合物滴加到细胞上并在37℃下孵育4小时。在4h结束时，收获细胞并用肝素（20U / mL在PBS中的肝素）洗涤三次以除去任何细胞表面结合的分子，重悬于500mu;L含有0.2％BSA和1mM EDTA的冰冷PBS CBE），然后使用LSRII（BectonDickinson）通过流式细胞仪进行分析。 细胞相关的荧光团在488nm处被激发，并在530nm处测量荧光。收集10000个细胞的荧光信号，并选择活细胞以获得每个细胞的荧光强度直方图。

摄取机制 将60nM EGFP和1.2mu;MPTDM-2在200mu;LPBS中混合，在室温下复合形成30分钟。对Jurkat T细胞进行计数，并在37℃或4℃下在800mu;L具有10％FBS的RPMI 1640培养基中或以800mu;L的ATP耗尽培养基（不含葡萄糖的RPMI 1640，含有20mM 2-脱氧-D-葡萄糖和10mM叠氮化钠）。将复合物逐滴加入到这些孔中，在37℃或37℃的ATP耗尽培养基中孵育1小时。 1小时后，收集细胞，用肝素（20U / mL PBS中的肝素）洗涤三次，以除去任何细胞表面结合分子，重悬于500mu;L含有0.2％BSA和1mM EDTA的冰冷PBS CBE），然后使用LSRII（BectonDickinson）通过流式细胞术进行分析。细胞相关荧光团在488nm激发，并测量荧光在530nm。收集10000个细胞的荧光信号，并选择活细胞以获得每个细胞的荧光强度直方图。

Cre递送到Cre / LoxP Reporter人体T细胞中。将Cre-Recombinase（从Excellgene购买）和PTDM-2以不同浓度（Cre：25-200nM; PTDM-2：0.25-2mu;M）以1:10的固定比例在200mu;LPBS中混合，并温育30分钟常温复合形成。计数Cre报告人类T细胞，并以将800mu;L无血清RPMI 1640培养液中接种于100000个细胞/孔的12孔板中。将复合物滴加到细胞上并在37℃下孵育2小时。然后，用含10％FBS的完全生长培养基更换无血清培养基，并在流式细胞术分析前将细胞孵育72小时。 72小时后，收集细胞洗涤两次，并重悬于含有0.2％BSA和1mM EDTA（CBE）的500mu;L冰冷的PBS中，然后使用LSRII（备课顿迪肯森公司）通过流式细胞仪分析。细胞相关的荧光团在488nm处被激发，并在530nm处测量荧光。收集10000个细胞的荧光信号，并选择活细胞以获得每个细胞的荧光强度直方图。

图2.通过不同PTDM以20的比例将EGFP递送到Jurkat T细胞的比较。（a）具有不同疏水性和阳离子性质的PTDM的结构并画草图表示。 红球代表疏水区，蓝色菱形代表阳离子含量。（b）EGFP阳性细胞的百分比。 ** PTDM-1对PTDM-2和PTDM-3的比较p lt;0.01。 （c）每个细胞的蛋白质摄取作为平均荧光强度。* PTDM-2与PTDM-1的比较p lt;0.05。PTDM-3与PTDM-1 的比较** p lt;0.01。（d）流式细胞仪分析显示未经治疗的Jurkat T细胞（实心灰色曲线）或用PTDM 1 / EGFP复合物（蓝色曲线），PTDM-2 / EGFP复合物（红色曲线）和PTDM-3 / EGFP复合物（绿色曲线）。 将细胞与PTDM / EGFP（1.2mu;MPTDM，60nM EGFP）复合物孵育4小时，在用含有肝素（20U / L）的PBS洗涤三次以除去细胞表面结合的分子后通过流式细胞仪分析。值和误差条代表三个独立实验的平均值plusmn;SD。

Runx1.d190输送到原代小鼠脾细胞。 裂解来自C57B1 / 6J小鼠的脾细胞中的红细胞。 将细胞重悬于补充有2mM谷氨酸，50单位/ mL青霉素，50mu;g/ mL链霉素和0.05mg / mL庆大霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）的HL1无血清培养基（Lonza，Allendale，NJ）中。 将0.9mL体积中的总共3.3times;10 6个细胞未处理或用下列方法孵育4小时：1.25mu;MPTDM，1.25nM PTDM与125nM EGFP（PTDM / EGFP）或125nM Runx1.d190（PDTM）复合 /Runx1.d190）以及125nM TAT-Runx1.d190。 加入总体积为100mu;L的PBS的所有处理。 只有PBS被添加到未处理的样品中。 孵育4小时后，将细胞以3000rpm离心5分钟。 除去上清液，剩余的沉淀用PBS洗涤并重新悬浮于0.5mL的Qiazol（Qiagen，Valenica，CA）中。

定量实时PCR分析。使用Qiazol（Qiagen）试剂说明步骤1-7，然后根据制造商的说明书，由RNeasy MinElute试剂盒（Qiagen）从样品中提取RNA。 RNA浓度和完整性由NanoDrop（Thermo Scientific，Hudson，NH）获得。用DNase（Invitrogen）处理大约1mu;g的RNA，根据制造商的说明书，使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA）进行cDNA合成。使用Takara SYBR Premix Ex Taq（Clontech，Mountain View，CA）进行实时PCR反应。所用的引物和循环条件如下：GAPDH转染5-CCAATGT GTCCGTCGTGGATCTG-3，GAPDH反向5TCCCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3，c-Myc正向5GAGACACCGCCCACCACCAG-3，c-Myc反向5-AGCCCGACTCCGACCTCTTG- 3。循环条件：95℃10秒，95℃5秒，60℃10秒，72℃22秒40个循环。对于随机选择的数据集，手动执行计算以确认与软件结果的一致性。 PCR产物也在2％Tris-乙酸酯-EDTA琼脂糖凝胶上解析，以确保样品中仅存在正确大小的单一条带。

统计分析。 结果以平均值plusmn;SD表示。使用GraphPad Prism 5.0进行的双尾学生t检验用于确定P值的统计学显着性。

图3. EGFP通过PTDM-2在有利于非宿主途径的条件下递送至Jurkat T细胞。 （a）流式细胞仪分析，显示在37℃，正常生长培养基（红色曲线）中，在37℃，ATP中以PTDM-2（1.2mu;M）/ EGFP（60nM）配合物处理的Jurkat T细胞以20的比例 分离培养基（含有20mM 2-脱氧-D-葡萄糖和10mM叠氮化钠的无葡萄糖RPMI;绿色曲线）和4℃在正常生长

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