以核磁共振为基础的代谢组学分析与治疗副作用白血病的发病机制及疗法外文翻译资料

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以核磁共振为基础的代谢组学分析与治疗副作用白血病的发病机制及疗法

摘要：

造血干细胞移植是干细胞治疗的最古老和最成功的方式。造血干细胞移植的高剂量治疗（HDT）允许医生施用增加化疗或辐射的量，同时减小负面影响如对骨髓造血干细胞的损伤。虽然造血干细胞移植的高剂量治疗能成功治疗多种癌症，但它会导致相关的致命的骨髓增生异常综合征或急性骨髓性白血病（MDS / AML）的产生，5 -10％的接受自体造血干细胞移植的患者产生霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在这项研究中，在一群患者进行造血干细胞移植前，我们进行了外周血干细胞样本的代谢组学分析收集，来深入了解t-MDS的分子和细胞的发病机理。用非参数检验和多因素分析来对样品中代谢物浓度进行比较，代谢物来自于近5年移植并产生t-MDS的患者与未产生t-MDS的患者。结果表明，t-MDS的产生与细胞代谢途径机能障碍有关。通过最高规范的代谢组学分析，包括丙氨酸代谢，天门冬氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，苯丙氨酸代谢，柠檬酸循环，氨酰基-T-RNA的合成。这些代谢的功能障碍表明线粒体功能存在障碍，这将导致分解由化疗和放射治疗产生的活性氧的能力下降，因此导致致癌突变。这些结果指示出了t-MDS疾病的诱发因素。

关键词：核磁共振，代谢组学，外周血干细胞，白血病

绪论：

干细胞疗法是目前生物医学研究的新领域潜在的最活跃的一个疗法，在治疗各种疾病和损伤中，当前的治疗方法不足以提供治疗时，干细胞疗法是最有潜力的一种疗法。造血干细胞移植是最古老和最成功的干细胞治疗方法。其次是造血干细胞移植大剂量化疗（HDT），它允许医生提高化疗和放疗的辐射量，通过自体骨髓或外周血造血干细胞得到救援。虽然造血干细胞移植大剂量化疗能成功治疗多种癌症，它同时也会导致治疗副作用的脊髓发育不良或急性骨髓性白血病（t-MDS / AML）的产生，5 -10％的接受自体造血干细胞移植的患者产生霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。引起骨髓增生异常综合征和急性髓细胞性白血病的分子机制到目前还是未知的。流行病学研究表明，红细胞积压接触性治疗，移植预处理方案，自体移植物的收集和造血再生对t-MDS的产生起着重要的影响，患者的骨髓中不发生t-MDS/ AML的更新和正常血细胞的生产。然而，这个过程就打断了一些患者的化疗或放疗过程，并且损害了造血干细胞分裂与分化细胞的过程，最终导致了致命的疾病。代谢组学成为系统生物学的一个重要的学科，并直接反映急性细胞状态。代谢组学也有对新的生物标志物疾病进行诊断和预防的潜力，例如：最近的代谢组学研究已经确定被称为肌氨酸的代谢物对前列腺癌的研究起着重要的作用，可作为前列腺癌诊断的生物标志物。核磁共振或大量的光谱分析法代谢组学分析总的细胞提取物的代谢物，核磁共振分析的优点是，信号强度与产生信号的分子数量成正比，各种代谢物的含量是不同的细胞通路活动的重要指标。此外，代谢组学核磁共振是不需要广泛的分离样品的色谱方法，另外，多维核磁共振方法可以用来解决在许多代谢产物的混合物中等的共振简并问题。

在这项研究中，我们进行了代谢组学分析，洞察急性骨髓性白血病分子和细胞的发病机理与机制，为了识别让患者易于产生急性骨髓性白血病的生物标志物，我们收集了12个异体基因造血干细胞移植病人的外周血干细胞(PBSC)代谢物样本进行分析，其中，6 位患者在进行异体基因造血干细胞移植后出现t-MDS ，另外6位患者（控制者）没有出现。用非参数测试和多变量分析来计算浓度并比较每个样本，通过分析已经确定的代谢物，显示了急性骨髓性白血病病例和对照组之间的统计学的显著差异。这些代谢物相关的顶级代谢途径包括丙氨酸代谢，天门冬氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，苯丙氨酸代谢，柠檬酸循环，氨酰基-T-RNA的合成。这些观察表明了急性骨髓性白血病的诱发因素。

实验过程：

患者的选择与样本收集

外周造血干细胞的样品来自于血细胞比容。在目前的研究中我们使用了嵌套式病例对照设计。这六个研究对象来自于国家希望医疗中心，患者在患非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤后通过异体基因造血干细胞移植后出现治疗相关性白血病。另外六个控制者是患非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤后通过异体基因造血干细胞移植后未出现治疗相关性白血病。表1给出了6例患者和6个控制者的相关信息，这些研究是由国家希望医疗机构审查委员会提交给美国并经美国卫生及公共服务部保证批准，并且满足赫尔辛基宣言的所有要求。之后，获得了所有受试者的知情同意，并对研究可能造成的后果进行了解释。

核磁共振波谱样品制备

对于每个样品，(1-4)*10^6个外周血干细胞在补充有20％的胎牛血清和2mM的均一的标记13C谷氨酰胺的培养基中保持37度温育18小时。细胞培养的浓度维持在每毫升含2-3times;10^5个细胞，并且每2 - 3天进行观察使细胞呈对数增长，细胞呈颗粒状沉淀，并用聚丁二酸丁二醇酯洗涤来去除之前的溶剂，记录湿的状态下的质量。如上所述，细胞代谢物用甲醇，氯仿与水的比例为2.0，2.0，1.8的最终比例提取。简而言之，将细胞沉淀物在7.4毫升/克冷的甲醇中进行超声处理，2.22毫升/克的冰水浴中处理1分钟。将匀浆转移至硼硅酸盐玻璃培养管中，加入3.7毫升/克的冷氯仿。将悬浮液持续搅拌，一整夜保持在4 摄氏度。向该单相溶液中加入3.7毫升/克的冷氯仿和3.7毫升/克的冰水，并将溶液涡旋，离心5分钟，将上层亲水层和下亲脂性层小心地转移到清洁的试管中，并在真空离心蒸发浓缩器中浓缩干燥。

核磁共振氢谱

从甲醇-水部分提取出的干燥亲水样品悬浮在添加有6.4mu;DSS（4,4-二甲氧基联苯胺盐酸盐；剑桥同位素实验室，MA）的400mu;L的100％水悬浮液中，内标物DSS作为化学位移参考和浓度标准。要用Bruker Avance 600分光计来收集极性样品的一维谱，得到到16 ppm的谱宽，1024个电压瞬变和32 000个数据点。

提取出的干燥亲脂样品悬浮在400微升添加有质量百分浓度为万分之五的四甲基硅烷（TMS；剑桥同位素实验室，MA）的氘代氯仿中，作为化学位移参考。用Bruker Avance 600分光计在90° RF脉冲时收集标准的一维氢谱，得到13 ppm的光谱宽度，10000个数据点，记录8000个电压瞬变以达到更好信噪比。

核磁共振数据和统计分析

将亲水样品的光谱导入Chenomx核磁共振套件处理器（6.1版本，Chenomx公司，埃德蒙顿，加拿大）进行傅立叶变换，基于三次基线调整和相位变化。以DSS甲基质子的化学位移作为参考，以6.4mu;M的DSS为参考，通过Chenomx核磁共振套件处理器得到DSS甲基质子峰的积分。该Chenomx核磁共振套件处理器从核磁共振波谱数据库中提取化合物的特征来识别代谢产物，Chenomx通过确定化合物的特征，确定与其光谱高度最相似的样品，计算出代谢物浓度。将计算出的浓度绘制成表，导出并保存在Excel工作表中。每3*10^6个细胞的浓度从微摩尔转向毫微摩尔，通过乘以样品的体积，调整样品中细胞的数目。每组病人的代谢物都进行惠特尼测试，使用StatistiXL软件（版本1.8；Statisti XL，Nedlands，澳大利亚西部），对所有患者的代谢物的数量进行比较。每个样本的代谢物数量都作为分析数据输入MetaboAnalyst中，16个数据行通过log2变换操作归一化和列归一化，再进行主成分分析（PCA），偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）和皮尔逊相关性检测。

结果：

HCT外周血干细胞样品亲水性代谢物的NMR谱研究

图1示出有代表性的得到控制的淋巴瘤患者和出现白血病病例的患者的1H NMR谱。大部分的谱图位于0和4 ppm的之间的高场区域，与脂族组织的代谢产物相对应。他们所含的化合物的光谱强度有明显的不同，比如二甲胺，谷氨酰胺，谷氨酸，谷胱甘肽，和亮氨酸。在这些例子中，他们的光谱强度均不同。Chenomx分析器是用来识别在光谱中可见的化合物，然而，一些共振仍然无法在图书馆中查明。如前所述，15个来自高速真空的样品被污染导致了N,N-二甲基甲酰胺2.9，3和8 ppm峰值的变异和集中浓度被排除在外。

非参数测试分析是用来比较每个样品的估算浓度。从大约50种代谢物鉴定并用惠特尼测试分出6种具有显著统计学意义的样品（p lt; 0.05；图2）， 样品中的丙酮酸在控制患者组平均低于那些从病人身上开发t-MDS的组。然而，2-氧戊二酸盐在控制样本中平均水平高于t-MDS病例，这些代谢物和线粒体功能直接相关。此外，t-MDS 患者的造血干细胞中增加了氨基酸。丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的水平增加。丙氨酸是直接来源于丙酮酸，它的水平的增加是与丙酮酸水平的增加直接相关的。白氨酸和苯丙氨酸合成乙酰辅酶a的线粒体，也来自丙酮酸。t-MDS / AML患者这些代谢物水平的增加可能是由于这些化合物的利用率或由于他们的合成增加。尽管如此，这些结果表明t-MDS患者不同的线粒体活动相对的得到控制。

多元分析也应用于识别两组病人之间的差异。主成分分析被用来分析确定代谢物的浓度。主成分分析表明，这两个群体并不是完全分开的两大部分，PC1和PC2（图3）。然而这两组可以依三大原则更好地分离，PC1、PC2和生物（图3 b）。而很难分开两组可能是由于他们的代谢组学差异。在患者身上单独控制和白血病样品的变化未被发现。因此，另一种可供选择的统计方法应用于进一步的数据检查中。通过偏最小二乘判别分析法分析是一种指导方法越来越多地用于代谢组学，当群集不能被主成分分析明显的分离时。判别分析还提供了影响分离的代谢物的识别。均可以用于主成分分析也用于判别分析，结果如图4所示。在控制组和t-MDS/ AML 案例沿着潜变量（LV）1轴有一个明显的区别，这对应很多不同的化合物（图4）。区别是更小化合物的独立性，LV2和LV3（图4 b）。

导致产生骨髓增生异常综合征或急性骨髓性白血病与对照组的区别的代谢产物得到了确定。除了那些由非参数测试发现的，判别分析已经鉴定出来更多的能使两组区分开来的化合物（图5）。七种化合物常作为参数检验和多因素分析来鉴别白血病病例和对照组。它们是丙酮酸，2-酮戊二酸，3-甲基组氨酸，丁酸盐，1-甲基组氨酸，辛酸盐和2-羟基丁酸。变量投影重要性指标指示出另外八种相关联的代谢物，它们的浓度能作为两组分离的重要指标（图5a）。相关性分析也确认了两组相关联的各种代谢物的浓度水平趋势（图5b）；相关系数接近-1或1则被认为是很强的相关性。两组患者之间共有30个代谢物由不同的统计分析得到鉴别识别。

为了生物信号通路机能障碍与副作用白血病的内在联系，即判别与对照组的情况下组的代谢物之间的联系，建立了病例组与对照组通过使用创新路径分析的代谢组学模块（IPA，万维网）（图6）。大多数这些代谢物的彼此通过直接化学反应连接（用实线表示）。只有三种代谢物，癸酸盐，辛酸盐和胆酸盐，是通过其它代谢物间接连接（虚线）。将三种代谢物连接到放大器，其统计分析得到的电平出现显著的不同。，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK1）需要将丙酮酸盐连接到癸酸盐上，这表明两组之间这种酶的活性是不同的。典型的途径分析鉴定发现出现白血病的（表2）患者与未出现的患者之间最显著的不同规范途径。这些代谢物相关的顶级代谢包括丙氨酸代谢，天门冬氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，苯丙氨酸代谢，柠檬酸循环，氨酰基-T-RNA的合成。所有这些途径由四个分子或更多分子共同控制。

异基因造血干细胞移植样本中亲脂性的代谢物核磁共振的分析

氯仿提取部分的光谱显示出了两组结果之间的显著差异（图7）。目前Chenomx库内并不包含有脂质组基因，因此，主要任务是比较已经公布的脂质核磁共振数据。观察到的最显著的共振是脂质胆固醇/甲基(0.8-1.1 ppm)，亚甲基质子(1.1-1.4 ppm)和脂质丙酰质子(1.4-1.7 ppm)，不同的脂质分子均包含这些官能团。由于脂质分子存在这共振简并，核磁共振光谱不能确定单个的脂质分子。因此，通过比较光谱的信号强度进行统计分析。主成分分析和判别分析法被应用确定光谱特征来区分两组病人。其次，主成分分析的最大主成分没有允许两组分离（图8）。然而，使用判别分析法为三个潜变量提供了良好的分离（LV1-LV3）（图9）。

用类似的方法来分析亲水性代谢物时，用可变信息处理和关联分析是来确定光谱特性，这有助于通过判别分析有效成功地分离病人群体。这些结果的常见区域有：1.8-2.0 ppm（乙烯基），2.30-2.325 ppm（alpha;-取代乙酸），4.05-4.075 ppm（CH2-O-P），4.175-4.2 ppm （-CH2-O-COR- ,-O-CH2-CH2-N-），5.35-5.40 ppm（alpha;-取代乙炔）。对得到控制的患者样本进行的相关分析还发现了在1.45-1.50 ppm领域内谱图的强度增加，与alpha;-取代丙酸出现共振。这些结果表明两组样品的脂质中合成和修饰过程的不同。从上面讨论的亲水样品中细胞通路识别可能导致亲脂性的分子观察出现差异。例如，信号强度在5.35-5.40 ppm（alpha;-取代乙炔）处增加与化疗药物使线粒体出现损伤有关。综上所述，亲脂性的部分也表示出现相关性白血病的病人与得到控制的病人相比，会出现内源性移动障碍（图10）。

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