不同碳源对黑曲霉生长特性的影响开题报告

1. 研究目的与意义

黑曲霉（aspergillusniger），属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是一种常见的丝状真菌，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。黑曲霉生长速度快、发酵周期短且不产生毒素，是经美国fda认证的安全菌种（gras）之一。研究发现，黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性^[1]。人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。随着对黑曲霉的深入研究，其更多的生产利用价值被开发。目前，黑曲霉在工业中得到广泛应用，如在柠檬酸以及各种高价值酶包括果胶酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶等的生产中^[2]。越来越多的外源蛋白在黑曲霉中成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，因此黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种^[3]。

黑曲霉在生长过程中会受到多种胁迫的制约，当受氧化胁迫时，细胞内超氧阴离子（^● o₂^-）、羟基自由基(^● ho)和过氧化氢( h₂o₂)等活性氧（reactive oxygen species，ros）大量积累， 导致菌体细胞的许多重要生物大分子发生不可逆转的氧化损伤，使核酸、蛋白质、膜和多不饱和脂肪酸等出现交联或断裂，致使细胞结构和功能的破坏，甚至引起细胞死亡^[4-5]。为了抵抗氧化损伤，黑曲霉会通过增强表达抗氧化酶和产生小分子抗氧化物去有效地清除ros，从而在氧化胁迫下维持菌体生长及代谢^[6-7]。抗氧化酶主要包括负责将^● o₂^-转化成h₂o₂的超氧化物歧化酶( sod )、把h₂o₂解离成水的过氧化氢酶(cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(gpx；而小分子抗氧化物很多都是真菌次级代谢产物如丙二醛（mda）^[8-9]。

氧化胁迫是黑曲霉生长繁殖环境面临的最主要的胁迫之一，深入研究黑曲霉在氧化胁迫下的生长代谢情况，明确其响应机制十分有必要。本研为发掘潜在工业耐氧化胁迫高产率发酵菌株提供理论依据，对以黑曲霉为细胞工厂的工业生产和需控制黑曲霉侵染的农业生产储存的健康发展有重要意义。

2. 研究内容和预期目标

研究内容:

本文以实验室前期分离得到的黑曲霉hy2为研究对象，研究其在不同碳源中不同浓度h₂o₂氧化胁迫下培养，分析菌落的生长情况，得出氧化胁迫规律。选定10mmh₂o₂胁迫，在不同碳源下培养，通过测定菌株产孢量、胞内h₂o₂含量、抗超氧阴离子活力、mda含量、cat、sod和gpx活力，flba和cat基因表达情况，探究黑曲霉生长代谢情况。对发掘潜在工业抗氧化胁迫高产率发酵菌株有重要指导意义，为黑曲霉工业化发酵生产各种酶制剂的应用提供保障。主要研究内容包括以下部分：本实验以添加外源h₂o₂营造氧化胁迫条件

3. 国内外研究现状

黑曲霉是自然界广泛分布的真菌，遗传稳定性极高，具有高效的蛋白表达和修饰能力。随着对黑曲霉的的生长特性、基因表达及生产应用的深入研究，它受到了越来越多的青睐，被国内外广泛用于食品酵工业 、酶制剂 、生物饲料和生物肥料上的益生菌等领域，有着极高的利用价值。近年来，也被用在废水处理方面，kang x^[10]等研究表明，黑曲霉通过生物质自然真菌培养系统，可使土壤和污水中的稀土元素达到生物转化和生物恢复的目的。为响应节约资源和环境友好型可持续发展，袁明贵^[11]等人以内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶的活力为指标，对氮源、碳源、含水量、发酵时间、浸泡液 ph 值和温度共 6 个单因素进行考察，探索了利用黑曲霉固态发酵凉茶渣进行资源化利用的可行性。

但在黑曲霉生长过程中，会面临各种各样的胁迫，氧化胁迫是最主要的胁迫之一。本实验以h2o2对黑曲霉进行胁迫，hong sy、passone ma、diezmann s^[12－14]等学者研究发现体外的h2o2作为一种强氧化剂，能够穿过细胞膜进入细胞内自由移动，使胞内 h2o2 含量增加的同时提高了o2- 的含量，导致自由基的产生与积累，造成细胞内的氧化损伤，甚至引起细胞死亡 ；为了减轻和修复氧化损伤，细胞通过提高自身抗氧化酶活力和增强次级代谢来对体内多余的活性氧自由基进行“解毒”与“排泄”。邱雪梅^[15]等人采用不同浓度梯度 h2o2 对肺炎克雷伯菌进行氧化胁迫处理; 测定细菌的生长曲线、检测细菌的关键毒力因子－荚膜与生物膜的生成量。发现在氧化因子胁迫下，当处于较低浓度范围(lt; 1.56 mmol/l ) 时，肺炎克雷伯菌早期生长受到抑制作用，中后期逐渐适应胁迫、其生长未受明显影响。此外，肺炎克雷伯菌在氧化胁迫条件下荚膜生成量明显降低，呈剂量依赖效应; 但在一定浓度范围氧化因子作用下，其生物膜的形成量增加。陈浩宇^[16]等发现黑曲霉在h₂o₂氧化胁迫黑曲霉下，生长被抑制，且受抑制作用与h₂o₂剂量有关，通过对黑曲霉菌体生长、ota 合成、胞内活性氧（ros）和脂质过氧化水平，以及抗氧化酶活性的测定，明确了黑曲霉在h₂o₂胁迫下的响应机制。

为了抵抗氧化胁迫造成的氧化损伤，黑曲霉会通过增强抗氧化酶活性和生成次生代谢产物来消除体内过多活性氧。在这过程中，探究不同碳源培养基对黑曲霉的响应氧化胁迫维持生长代谢的影响，可为发掘潜耐胁迫高产率发酵菌株提供依据。周晨妍^[17]等人采用单因素试验和Ｌ₉(3⁴)正交试验方法，分别研究了碳源、氮源、表面活性剂、培养基初始ph、料水比、培养温度及时间对黑曲霉xz - 3s 产纤维素酶的影响,在此基础上研究发现：麸皮与玉米芯的比例6 : 2，硫酸铵浓度4.0%，吐温－400.4%，发酵培养基初始ph4.0，培养温度28℃，培养时间96 h，培 养 基 料 水 比 1:1.5时为黑曲霉 xz - 3s产纤维素酶的最优固态发酵条件。孙俊良^[18]等人研究可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和β^- 环糊精为碳源时，分别对黑曲霉产糖化酶活力的影响。结果表明，可溶性淀粉为碳源时酶活力最高，最高可达350.34 14.06u/ml；其次是葡萄糖；蔗糖和麦芽糖为碳源时酶活力没有显著性差异；乳糖为碳源时酶活力低于蔗糖和麦芽糖；β^- 环糊精的酶活力最低。不同碳源发酵培养基中生物量研究表明，黑曲霉能充分利用可溶性淀粉、 葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，对乳糖的利用较差，几乎不能利用β^- 环糊精。

4. 计划与进度安排

研究计划及进度：

2010-10-10~2020-11.10

拟定课题研究计划，开展文献资料搜集、查阅工作，了解目前国内外在此研究方面的动态。

5. 参考文献

[1] 张熙,韩双艳.黑曲霉发酵产酶研究进展[j].化学与生物工程,2016,33(01):13-16.

[2] 娄行行,魏天予,芦红云,陈启和.微颗粒对黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的影响[j/ol].中国食品学报:1-9[2021-04-14].

[3] patwl h,chapla d,divecha j, et al. improved yield of a-l-arabinofuranosidase by newly isolated aspergillus niger adh-11 and synergistic effect of crude enzyme on saccharification of maize stover [j] .bioresourcesamp;bioprocessing,2015,11(2):157-619.