凝结芽孢杆菌杆菌乳酸脱氢酶催化性质和反应机理研究开题报告

1. 研究目的与意义

目的意义丙酮酸生物制备中乳酸氧化生成丙酮酸反应时关键步骤，常规工艺采用酶种为乳酸氧化酶，本研究探索乳酸脱氢酶制备丙酮酸的可能性为开拓丙酮酸制备酶源提供依据。通过建立用HPLC同时测定乳酸和丙酮酸的方法、研究凝结芽孢杆菌乳酸脱氢酶正逆反应的研究，优化乳酸脱氢酶催化乳酸制备丙酮酸反应体系。

生物学迅速发展，用现代生物科学理论和现代生物技术从事生产研究已进入蓬勃发展的时期，在2010中国生物药物创新研究论论坛^[4]中，中国药科大学生命科学与技术学院的杨皓宇、吴梧桐、高向东的由DL-乳酸生产丙酮酸的酶法工艺研究进展成为该论坛中重要的一项研讨。由此可见乳酸脱氢酶的研究涉及医药学，研究的前景广阔。

2. 国内外研究现状分析

1.国内外研究现状

国内外有关专家主要通过物理诱变、化学诱变、原生质体融合与基因工程技术等进行L- 乳酸高产菌株的选育,以提高菌种产L- 乳酸的能力,可得到光学纯度较高的产品^[5]。乳酸脱氢主要存在于动物的肌肉中。该酶的分子中含有四个亚基(subunit),分子量130000～ 145000^[6]。在乳酸的旋光异构体中，L-乳酸受到越来越多的重视，L-乳酸及其衍生物是多用途的精细化学品，主要应用于食品、酿造、日用化工、制药、纺织、环保和农业等诸多领域，特别是以L-乳酸为原料生产的聚合物聚乳酸(PLA)是理想的绿色高分子材料，原料来源充分而且可以再生，世界知名公司包括美国ADM公司、杜邦公司、陶氏化学等公司已大力开发这一广泛应用的环境友好材料，利用农副产品为原料发酵生产L-乳酸，进而生产聚乳酸，最终形成产业化^[7]。

Hakki E E, Akkaya M S等人^[8]采用基因工程方法重建Lactobacillus helveticus 基因,用l dhL 基因代替 l dhD基因,使L-乳酸产量提高了20%。近年来，随着分子生物学技术的进步，从分子水平上研究氨基酸结构与基因高效表达引起了国内外学者的广泛关注，李剑^[9]等构建了产D-乳酸和L-乳酸的乳杆菌( Lactobacillus sp)MD-1的基因文库并克隆出l dhL基因，经过序列分析，发现l dhL基因编码的蛋白质有3个保守区域，其中Asp73Ile100和Asn123Arg154是酶的活性部位，Gly13Asp50是NADH的结合位点，该l dhL基因和其他乳杆菌的l dhL基因序列相似性为64.11%，其编码的氨基酸序列相似性为68.19%，诱导表达的粗蛋白酶活为4.64 U/mg。对表达的L-LDH生物学特异性研究^[10]显示：最适反应温度为40℃45℃；在45℃以下能维持较高酶活；果糖-1,6-二磷酸(FBP)为别构激活剂，使最适pH向中性方向偏移(pH为6.66.8)，Mn² 可拓宽最适酶活pH范围；L-LDH在酸性环境中较稳定，维持在75%以上；酶催化反应最适NADH浓度为0.174 mmol/L，最适丙酮酸浓度为20mmol/L，未添加激活剂时，底物[S]对V的动力学曲线是S形曲线，而添加激活剂后，动力学曲线变成了双曲线；Mn² 、Ca² 和Mg² 对L-LDH有激活作用，而Zn² 对L-LDH有抑制作用。当反应体系中乳酸浓度小于0.22 mol/L时，酶活量仍保持较高，当乳酸浓度大于0.44 mol/L时，酶活力大幅度下降。

周林^[11]等研究了耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis )产酶特性并对其产酶条件作了优化。在耻垢分枝杆菌的基础培养基中加入了DL-乳酸，对产酶进行了研究，进行传代培养，在第五代的时候酶活测定达到了65.8 U/mL，用包埋交固定耻垢分枝杆菌生成乳酸氧化酶的最佳条件,比较了原酶与固定化酶的酶学性质。酶学性质研究表明,此固定化酶的热稳定性较好，游离酶在65℃保温1 h酶蛋白完全变性失活,而固定化酶在65℃保温1h仍可保持86%的酶活力，固定化酶最适反应温度可由37℃升变为55℃,最适反应pH=7.4;在不加保护剂的条件下,4℃放置50 d后游离酶仅保持40%以上的酶活力,而固定化酶能保持80%以上的酶活力。该固定化乳酸氧化酶用于催化氧化DL-乳酸生产丙酮酸,3 h后丙酮酸产率可达75%,连续循环使用5次固定化酶活力仍保持85%^[12]。

为进一步研究乳酸脱氢酶的性质，石轩峰,谢慧,杨海麟,王武探讨了乳酸分离纯化工艺，在植物乳杆菌乳酸脱氢酶的分离纯化工艺研究^[13]中，采用了硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose F.F.离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 F.F.疏水层析及Sephadex G-75Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化,确定了较为合理的纯化工艺.酶纯化效率达到了21.4倍，酶回收效率达到了53.9%，提高了乳酸脱氢酶的纯化效率。乳酸脱氢酶是以辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为辅酶，将EMP 途径最后一步反应得到的丙酮酸转化成乳酸的关键酶。

E. Silverstein 等^[14]证实该反应按如下机理进行,即酶(E)总是首先与辅酶(NAD )结合为二元复合物。与此同时, 酶的构象发生改变, 然后再结合底物L 2乳酸(S)进行反应。反应时先释放出产物丙酮酸(P),然后酶与还原辅酶(NADH)分离^[15],反应中生成的H 首先转移到酶的残基(His2195)上,反应后再由酶释放出去,完成催化反应。早在1996年朱文森^[16]等人的枯草芽抱杆菌BS12乳酸脱氢酶的分离纯化与部分性质的研究中就测出了枯草芽孢杆菌BS12乳酸脱氢酶的纯化，具体如下表1。

表1 枯草芽孢杆菌BS12LDH的纯化

	总蛋白（mg）	总酶活（u）	比活（u/mg）	提取倍数	回收率（%）
无细胞抽提液	3272	393	0.12	1	100
（NH4）2SO4沉淀	1591	244	0.15	1.25	62.1
CM-纤维素层析	300	164	0.55	4.58	41.7
DEAE-纤维素层析	51	112	2.20	18.33	28.5
Sephadex G-200层析	7.4	91	12.30	102.50	23.2

王丹^[17]等人从污水处理池及其附近土壤中分离得到36株可将丙酮酸乙酯不对称还原成(S)-乳酸乙酯的菌株，经过多次复制与赛选获得了具有较高催化活性的酵母菌BTY18-6。以这种酵母菌静息细胞为催化剂，进行丙酮酸乙酯不对称还原成(S)-乳酸乙酯的反应，并对反应进行了优化。并发表了关于酵母菌静息细胞催化丙酮酸乙酯不对称还原成(S)-乳酸乙酯的文章，对底物、产物浓度、活性及反应温度、pH等进行了优化。研究出酵母细胞代谢葡萄糖产生了一系列的氢受体中间产物与丙酮酸乙酯竞争活性氢而被还原，使得转化效率比较低。对反应条件的优化能够使得催化活性提高。

吴新宇、董英在乳酸脱氢酶高产菌株的分离筛选与初步鉴定^[18]实验中，通过筛选食品和土壤等样品中的芽孢杆菌，分离纯化得到136株菌株，经过培养和镜检，再筛选到12株菌株，比较其产乳酸脱氢酶的活力，其中ＢＪ07活力最强，其细胞破碎液的酶比活为0.26 U／ｍｇ。经过形态和生理生化鉴定，初步确定ＢＪ07菌株为枯草芽孢杆菌，研究其生物学特性，测定该菌株的生长曲线，其最适生长温度为34℃。

目前的乳酸生产主要是通过发酵糖类提取出生物质。Ping Xu、Jianhua Qiu、Cuiqing Ma、Chao Gao^[19]等人认为乳酸应该被视为绿色化学的未来，丙酮酸通过生物催化作用可产生乳酸则是全新的一个平台。通过固有的电子传递链使得假单胞杆菌乳酸脱氢酶诱导催化产生乳酸。在目前乳酸氧化机制中已经能够脱去辅助因子和中间产物过氧化氢，并且能够用DL-乳酸作为底物在假单胞杆菌乳酸脱氢酶的催化下产生丙酮酸。在最优条件下生物催化的过程产生较高浓度的丙酮酸（浓度为48.4gl-1）和高转化率(98%)。这项研究为生物转化系统提供了一个能够生产丙酮酸的很具有前景的方法。构建反应体系，全细胞进行细胞抽提，去除杂质，再用HPLC的方法同时测定丙酮酸和乳酸含量测定的方法。

2 生物法合成丙酮酸

丙酮酸的合成方法主要有化学法、生物法。化学法合成丙酮酸存在着产率低,污染严重,生产成本高等一系列问题。生物法合成丙酮酸主要有酶法和发酵法。丙酮酸在糖代谢中处于最具活力的中间点,在细胞中很容易变成其他物质故很难积累, 所以通过微生物发酵生产丙酮酸的方法的转化率往往较低,另外丙酮酸作为发酵产物混合物的一种成分,浓度一般都比较低,从复杂的发酵液中分离提取丙酮酸,一般难以进行,花费也较大。酶法转化生成丙酮酸最适合的底物就是乳酸，乳酸脱氢酶可以催化乳酸产生丙酮酸，而丙酮酸的价格是乳酸的20倍，使得这项研究成为时下热点之一。

由于NAD 价格的昂贵,从而限制了乳酸脱氢酶的应用, 这就使人们把目光投向乳酸氧化酶。近年来, 关于乳酸氧化酶催化生成丙酮酸有大量的研究。2007 年, Cuiqing Ma^[20] 等研究了一株施氏假单胞菌产乳酸氧化酶氧化乳酸生成丙酮酸, 其生物转化率为88.6% , 24 h可将25.5 g / L DL- 乳酸转化为22.6 g/ L 的丙酮酸, 该菌株的乳酸氧化酶氧化乳酸生成丙酮酸不产生过氧化氢, 2009 年, 其对该菌株的产酶特性作了进一步的研究,为酶法工业生产丙酮酸提供了可行性。

3. 研究的基本内容与计划

第1～ 3周 进行预实验了解实验室的基本规则及实验的大致过程，通过观察动手来学会运用实验操作过程中所必须的仪器、试剂等的使用方法和注意事项。完成毕业论文的开题报告。

第4周 正式开始实验

（1） 建立实验必须的分析方法。（hplc同时测定乳酸和丙酮酸方法建立）

4. 研究创新点

L-乳酸脱氢酶是在乳酸代谢途径中催化丙酮酸转化成乳酸的关健酶。而本项实验是在乳酸脱氢酶催化丙酮酸产生乳酸的基础上研究凝结芽孢杆菌乳酸脱氢酶催化性质和反应机理，探索乳酸脱氢酶制备丙酮酸的可能性，为开拓丙酮酸制备酶源提供依据。