纤维素固定化胰蛋白酶工艺的探讨开题报告

1. 研究目的与意义

酶作为一种特殊的生物催化剂，具有较高的选择性和催化效率、反应条件温和、催化活性可以调节控制等优点。但自由酶对所处环境十分敏感，在强酸、强碱、高温、高离子浓度和部分有机溶剂中均不够稳定，容易导致酶蛋白的变性， 从而降低甚至丧失其催化活性。同时，自由酶反应后不易与底物和产物分离，既影响反应产物纯度又难以重复使用，这在很大程度上限制了酶促反应的广泛应用。

为了提高胰蛋白酶的使用效率，克服溶液酶对热、酸、碱、有机溶剂等因素的不稳定性，使其回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉，研究木瓜蛋白酶适宜的固定化技术受到广泛关注。

而本选题固定化方法采用的滤纸和高碘酸钠价格便宜，使用方便，酶结合反应条件温和，且整个固定化过程中都没有使用有机溶剂，比较安全，易于推广。

2. 研究内容和预期目标

本实验采用滤纸作为纤维素膜载体，采用高碘酸钠氧化法在纤维素滤纸上固定化木瓜蛋白酶的方法，研究最佳单因素条件，并进行正交实验优化固定化条件。另通过测定比较溶液酶和固定化酶的米氏表观常数研究固定化酶与底物的亲和力。

本实验的关键问题是研究高碘酸钠法固定化木瓜蛋白酶的最佳固定化条件，测定溶液酶与固定化酶的米氏表观常数。

写作提纲：1、前言；2、实验材料与仪器；3、实验结果分析；4、实验结论；5、参考文献

3. 国内外研究现状

固定化酶是酶工程的核心，利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离。常用的固定化酶的方法有：吸附法包埋法交联法和共价结合法等，近几年研究出了一些新型的固定化技术，如交联酶聚集体定向固定和共固定技术。

邵文海、曹黎明等先后对定向固定化方法做了综述，据报道定向固定化酶的方法有：氨基酸置换法、抗体偶联法、生物素- 亲和法、疏水定向固定法、酶和金属离子连接法、共价固定法等。Huang等通过定点突变在枯草蛋白酶(subtil-isin)分 子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，利用Cys残基上的巯 基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果。Lesaicherre M L等分别通过生物素和其抗体之间的 亲和作用、硫酯和N 末端含半胱氨酸的通过化学连接反应实现缩氨酸在玻璃载体表面的定向固定。

4. 计划与进度安排

第一部分：以纤维素为载体，采用交联法将胰蛋白酶固定，测定不同交联剂的浓度，交联的pH、活化时间、酶浓度、交联温度、交联时间对固定化蛋白酶活性的影响。

第二部分：测定溶液酶与固定化酶的米氏表观常数。

5. 参考文献

[1] 姚晓玲,库汉生,宋卫江.不同载体固定化胰蛋白酶条件研究[j].生物技术,2007,17(3):71-73．

[2]李珊珊. 介孔分子筛sba-15中胰蛋白酶组装及催化活性研究[j]. 齐齐哈尔大学学报,2011,27(3):72-75

[3] 姚晓玲,库汉生,宋卫江.不同载体固定化胰蛋白酶条件研究[j].生物技术,2007,17(3):71-73