椎体虫中泛素蛋白的质粒构建开题报告

1. 研究目的与意义

Ubiquitin蛋白在真核生物中可以作为信号分子介导蛋白质到蛋白酶体中

进行水解。在结核杆菌中有蛋白酶体复合物，但是一直以来在原核生物中都没有发现ubiquitin蛋白，直到2008年人们首次在结核杆菌中发现了原核生物的ubiquitin蛋白（Pup）。并确定了Pup蛋白在结核杆菌中介导目的蛋白的水解。

2. 研究内容和预期目标

目的蛋白的纯化由于SUMO蛋白已经确定在上清中表达，为了后续的实验我们需要将SUMO蛋白从细胞裂解液中分离出来。蛋白质的诱导表达和细胞破碎的步骤如上所述。由于pET-22b( )表达载体是在C 端含有 His-tag 融合标签（LEHHHHHH），所以SUMO的融合蛋白可以用镍柱亲和 (Pharmacia) 纯化。Ni-NTA 胶体可以特异性地与融合的SUMO蛋白 C 末端的六个组氨酸（His）发生鳌合作用，但是细菌中的其他内在固有蛋白质没有 His-tag 不能与胶体结合，因此在咪唑浓度梯度洗脱缓冲液的作用下，可以将不含有His的蛋白质从亲和柱上洗脱出去，得到纯度较高的带有 His-tag 的SUMO蛋白。

蛋白质的透析和超滤透析袋用10mM NaHCO3、10mM EDTA、PH8.0的溶液煮沸10分钟，以除去残留的其他蛋白质，然后用去离子水继续煮10分钟，冷却后用去离子水清洗干净，然后将纯化后的蛋白质装如透析袋中，在25mM的磷酸盐、100mM的NaCl，2mM EDTA，PH6.25的溶液中透析至咪唑几乎没有（一般换液四到五次）。然后用超滤杯将目的蛋白超滤至500ul。

3. 研究的方法与步骤

本试验主要利用蛋白质重组技术将泛素蛋白ubiquitin基因插入到氨苄青霉素抗性的质粒中，然后对蛋白质进行体外表达并纯化的过程。本试验的内容主要包括一下几个方面：

1，目标基因的扩增，酶切

2，目标基因插入到载体中

4. 参考文献

Yi Sun. E3 Ubiquitin Ligases as Cancer Targets and Biomarkers. Neoplasia . Vol. 8, No. 8, August 2006, pp. 645 – 654.

朱玉贤，李毅，邓晓峰. 现代分子生物学[M].第3版.北京：高等教育出版社，2007年11月：156～157.

5. 计划与进度安排

1，3月2号-3月30号 目标基因的扩增，酶切，插入及检验

2，4月1号-4月15号 目标基因的蛋白表达及检验

3，4月16号-4月30号 目标蛋白的纯化