椎体虫中剪切型SUMO蛋白的质粒构建开题报告

1. 研究目的与意义

自从1996年SUMO的第一个底物RanGAP1被发现之后（Matunis et al., 1996），到现在为止已经有超过120种底物蛋白被鉴定出来。大部分的底物蛋白都是细胞核内蛋白，调节着细胞内的重要的生理功能，如染色体转录、染色体结构维持、DNA修复和核转运等。虽然SUMO修饰改变蛋白底物的活性的机制还需要很多的研究来发现，但是我们已经知道SUMO通过翻译后修饰底物蛋白调节其活性和定位进而在细胞增殖、分化和凋亡中起着很重要的功能。

越来越多的实验证据表明SUMO蛋白和底物蛋白的SUMO化与人类的很多疾病是相关的，这些疾病包括癌症、神经退行性疾病如阿尔海默症、帕金森症、肌萎缩性硬化症和亨廷顿病、糖尿病以及发育性疾病如兔唇等。这些疾病或者是由于SUMO途径的下调或者是染色体定位出现问题或者是改变了SUMO底物蛋白的功能。虽然这些疾病的发病机制和分子基础需要进一步探索，但是很多证据表明SUMO途径或者SUMO底物蛋白可以治疗提供靶向位点。同时SUMO的研究也为我们对一些人类的疾病的治疗和药物的开发起着很重要的作用和意义。

2. 研究内容和预期目标

1，目标基因引物设计和扩增。

2，目标基因插入到载体中，完成质粒构建。

3，目标基因的表达。

3. 研究的方法与步骤

首先进行椎体虫活化培养，恒温培养箱中将椎体虫细胞培养到细胞生长末期，具体步骤如下：（1） 取出9ml培养至末期的细胞，10000rpm离心2min，去除培养基，加入200ulte缓冲液进行细胞的重悬；（2） 然后再加入400ul 细胞裂解缓冲液漩涡振荡器上震荡混匀，加入15ulproteinase k 摇匀，将混合液置于55℃水浴中30min，其间上下颠倒几次；（3） 向温浴后的裂解液中加600ul氯仿，然后上下颠倒混匀，注意不能太剧烈，以保证dna完整性；（4） 在离心机中10000rpm离心10min，离心管中液体分为三层，最下层为氯仿，中层为蛋白，上清中含有基因组，小心吸出上清至一个1.5mlep管中；（5） 加入500ul precipitation solution混匀，室温放置5min，10000rpm离心2min，除去上清，立即加入100ul 1.2mol/l nacl溶液，轻轻振荡使dna完全溶解，加入10ulrnase以除去基因组中含有的rna,然后将溶液置于37℃放置10min；（6） 加入400ul冰箱中预冷的无水乙醇，-20℃放置30min，有白色沉淀析出，10000rpm离心10min，除去乙醇，用70%乙醇洗涤一次，10000rpm离心5min，弃去上清后倒置于超净台内晾干，最后用100ul去离子水溶解。

目的基因表达与检测

表达：1，取20ul的甘油菌接种到5ml的含有100ug/ml氨苄青霉素的lb培养基中过夜培养以活化细胞。2，分别取500ul培养后的菌液接种到两管5ml的含有氨苄的培养基中，培养至od600 0.6-0.8，在其中一管中加入 iptg 使其终浓度为1 mm，另一管作为对照不加入iptg，继续培养4小时。3，分别取3ml培养基10000 rpm，2min 离心收集菌体。加入1x上样缓冲液混匀后100℃煮沸5分钟。5000rpm离心5分钟。4，分别取诱导和对照的上清进行sds-page电泳检测以观察是否有蛋白表达。

4. 参考文献

[1].schmidt m., et al. (1994) symmetric complexes of groe chaperonins as part of thefunctional cycle. science 265: 656–659.

[2].burns ke., et al. (2009) proteasomal protein degradation in mycobacteria is dependent upona prokaryotic ubiquitin-like protein. j biol chem. 284(5):3069-75.

[3].刘志国，屈伸.基因克隆的分子基础与工程原理[m].北京；化学工业出版社，2003；156-178.

5. 计划与进度安排

1，3月2号-3月30号 目标基因的扩增，酶切，插入及检验

2，4月1号-4月15号 目标基因的蛋白表达及检验

3，4月16号-4月30号 目标蛋白的纯化