反硝化厌氧甲烷氧化过程的影响因素研究开题报告

1.1研究背景

1.1.1氮素污染及其危害

地球各元素总量中位列第四的氮素（N），对生物的生命活动起着关键作用，是蛋白质、遗传材料以及叶绿素和其它关键有机分子的基本组成元素。近年来，氮肥的普遍施用、工业废水的不达标排放以及生活污水的随意排出都使得水体中无机态氮素（亚硝态氮、硝态氮以及铵态氮）的浓度不断升高，导致生态系统的失衡，引发大规模的水体富营养化和藻类水华现象。

20世纪70年代起，硝态氮因其自身的稳定性，成为人们首要关注的对象。20世纪80年代后，我国因大量施用氮肥，导致50%以上地区的地下水和饮用水中硝态氮浓度超过最低标准。2000年陈荷生等^[1]在太湖设置的24个监测点中，79%受到了不同程度的氮素污染，且受污染的水质劣于Ⅳ类，点位的监测表明太湖8%为中富营养水平，92%为富营养化。根据我国最新统计年鉴可知，全国废水中总氮排放量达304.14万吨。河流、湖泊富营养化的出现将导致水体中溶解氧的含量急剧降低，大量水生生物缺氧而死，对渔业的稳定造成冲击。爆发式生长的藻类，不仅散发恶臭影响周围环境，而且能够分泌出麻痹性贝毒（PSP），如果人类不慎饮用将引起病变甚至死亡。饮用水体的富营养化则将给后续的水处理过程提升难度，增加额外的费用支出。

2016年，Han等人^[2]调研了中国境内52个地下水系统，结果显示70%浅层地下水的硝酸盐浓度都高于EPA规定上限（10mg N/L）,深层及岩溶地下水系统的硝酸盐污染则较轻，约为27%，其中邻渤海区域污染最为严重。Bilsborough等人^[3]认为地下水中硝酸盐的浓度与人口数量密切相关。2015年，Zhang等人^[4]探究了珠江三角洲区域地下水中硝酸盐浓度与人口数量、人口密度、工业废水排放和生活污水排放的关系，结果表明该地区硝酸盐浓度与工业废水排放以外的其他因素都成正相关，也间接验证了地下水中的硝酸盐主要来自生活污水。

在世界上的许多地区，公共供水中的硝酸盐浓度已超过了可接受的水平，高浓度的硝酸盐可引发儿童高铁血红蛋白血症，同时硝酸盐还是高致癌物质亚硝胺形成的前体。2012年，延利军^[5]对我国食道癌和肝癌高发区的水体进行了检测，结果均显示硝酸盐含量略高，这表明水中硝酸盐对癌症的发生起着一定的促使作用。

1.1.2甲烷排放情况及其危害

在工业化与城市化的进程中，人类不断干涉自然生态系统，引起了一系列环境问题，如全球气候变暖、酸雨、臭氧层空洞等。温室气体作为全球气候变暖的成因，引起了各界的广泛关注。2005年，《京都议定书》正式生效，成为第一部限制温室气体排放的法规，并规定了需要控制的6种温室气体：二氧化碳（CO）、甲烷（CH₄）、氧化亚氮（N₂O）、氢氟碳化合物（HFCs）、全氟碳化合物（PFCs）、六氟化硫（SF₆）。

中国是甲烷排放的大国，也处于甲烷浓度高值区。作为仅次于CO₂的温室气体，政府间气候变化专门委员会（IPCC）第五次评估报告指出，在过去一个世纪里，甲烷的全球增温趋势（GWP）是CO₂的28倍，在大气中将停留近9.1年^[6]。在人类活动的不断影响下，大气中甲烷的浓度已从1750年的722ppb增长至1859±2ppb，是工业化前的257%，并仍在继续上升^[7]。

甲烷的来源主要分为自然生态和人类活动，其中自然源占30%，如生态湿地、海洋沉积物和可燃冰等，人为源占70%，包括人工湿地、煤炭石油的开采和农业活动等。对流层与平流层中的化学转化过程则是甲烷主要的汇，甲烷在对流层中与羟基发生反应，进而影响臭氧、氮氧化物等物质的浓度，还有约10%的甲烷进入平流层，影响着平流层物质的转化。

因此，甲烷自身的高增温趋势、高人为源占比，使其相比较于控制二氧化碳而言，在减缓温室效应方面有着更大的优势与效果。

1.1.3反硝化型厌氧甲烷氧化的研究进展

1.1.3.1 DAMO过程的发现

甲烷C-H键的断裂需要很高的活化能，而好氧甲烷氧化菌可以将氧气作为高活性共基物，通过催化甲烷单加氧酶来提供甲烷氧化所需的活化能。因此人们对于甲烷分解的印象一直停留在有氧甲烷氧化，直到1974年，Martens在厌氧海洋沉积物中发现了厌氧甲烷氧化（anaerobic oxidation ofmethane，AOM）耦合硫酸盐还原过程，改变了人们的认知。这一过程多发生在硫酸盐—甲烷过渡带、厌氧甲烷氧化带以及厌氧海洋沉积物中^[8]，消耗了冷渗透沉积物所产生的90%以上的甲烷和海洋沉积物中的大部分甲烷，对控制进入大气的甲烷通量具有很大的贡献^[9]。硫酸盐型厌氧甲烷氧化过程（sulphate-dependentanaerobic methane oxidation，SAMO）是由两类微生物协同催化完成：厌氧甲烷氧化古菌（anaerobic methanotrophicarchaea，ANME）和硫酸盐还原细菌（sulfate-reducing bacteria，SRB），其中ANME古菌通过逆向产甲烷途径氧化代谢甲烷，在此过程中产生的中间产物则作为电子供体被SRB细菌氧化为硫化物。这两种菌通常在沉积物中占据不同的生态位，且与深度密切相关。

通过比较SO₄^2—和NO₂^—/NO₃^—分别作为厌氧甲烷氧化电子供体时的吉布斯自由能，研究学者们发现NO₂^—/NO₃^—作为电子供体的反应更易自发进行，由此猜想自然界中存在某种异养微生物，进行着该类反应，但因其苛刻的生存环境（有氧/缺氧界面附近）,很长一段时间内均未发现该种功能微生物的踪迹。

直至2004，墨西哥学者Lslas-Lima等^[10]首次在实验室中证明了厌氧甲烷氧化耦合硝酸盐/亚硝酸盐还原的过程：在缺氧反硝化的条件下，以甲烷作为唯一碳源的批量实验中，硝酸盐和甲烷同时被消耗，但并没有对微生物菌群进行分析。

2006年，荷兰Raghoebarsing等^[11]以受氮素污染的荷兰运河沉积物为接种泥，在甲烷和硝酸盐16个月的培养下，成功富集了能够完成厌氧甲烷氧化耦合硝酸盐还原过程的微生物群落，并将此反应过程称为反硝化型厌氧甲烷氧化(denitrifying anaerobicmethane oxidation，DAMO)，化学方程式见（1）（2）。并通过同位素示踪、16S rRNA基因检测等技术鉴定了富集体系中的微生物，主要分为两类：一类是未被培养的NC10门细菌，另一类为厌氧甲烷氧化古菌（anaerobic methanotrophicarchaea，ANME），不同于SAMO富集物中细菌与古菌数量2:1，这二者比例约为8:1。前者由Ettwig等命名为Candidatus Methylomirabilis oxyfera（简称M.oxyfera），后者与海洋甲烷氧化古菌有着较远的亲缘关系，并由Haroon等人证实其属于ANME-2d。

5CH₄ 8NO₂^— 8H →5CO₂ 4N₂ 14H₂O （1）

3CH₄ 8NO₃^— 8H →3CO₂ 4N₂ 10H₂O （2）

随后，研究学者们又相继在德国康斯坦茨湖^[12]、荷兰污水处理厂^[13,14,15]、中国水稻田^[16]、西湖^[17]、南海^[18]、中国东部淡水湿地^[19]、钱塘江^[20]等生态环境中发现了DAMO微生物，这一偶联全球碳氮循环的过程引发了国内外对于DAMO微生物的探讨研究，包括其代谢机理、实验室富集、影响因素、应用前景等。

1.1.3.2 DAMO过程的机理

关于DAMO过程的机理主要分为两种：一种是2006年Raghoebarsing等人提出的由ANME古菌完成的逆向产甲烷途径耦合反硝化机理^[11]；另一种则是2010年Ettwig等人提出的由M.oxyfera菌进行的新型内部好氧反硝化机理^[21,22]。

产甲烷过程中的大部分酶促反应均可逆，由此人们猜想存在由ANME古菌独立完成的逆向产甲烷途径，使其成为了AOM过程中被最早提出的理论。2004年，Hallam等^[23]构建了逆向产甲烷途径的模型：在甲基辅酶M还原酶（methyl-coenzyme Mreductase，MCR）的作用下，甲烷被活化，然后在一系列脱氢酶的作用下，甲烷被氧化为二氧化碳。2006年，Raghoebarsing等人^[11]在对DAMO富集物进行分子生物学分析时，发现了逆向产甲烷过程中会出现的中间产物甲酸、乙酸盐等，由此推测DAMO过程由ANME古菌和M.oxyfera菌协同完成，甲烷在ANME古菌作用下，通过逆向产甲烷途径转化为二氧化碳，在此过程中生成的中间产物则作为M.oxyfera菌的电子供体，使其最终完成反硝化过程。

然而在后续的研究中，Ettwig等人^[21]发现在ANME古菌逐渐减少的情况下，AOM过程仍能顺利进行，由此推断DAMO过程不需要古菌的参与，逆向产甲烷途径也并不能完全解释DAMO过程，反之提出了内部产氧途径，成为除光合作用、活性氧簇作用和氯酸盐呼吸以外的第四种产氧途径，改变了人们对缺氧条件下烃降解的既定认知。该过程为：在亚硝酸盐还原酶（Nir）的作用下，亚硝酸盐被还原为一氧化氮，随后在一种未知的NO歧化酶（至今尚未检出）的作用下，分解为氮气和氧气，其中四分之三的氧气用于甲烷的氧化，余下的四分之一则用于自身呼吸作用。这一机理也在2012年被Wu等人^[24]用免疫金标记法所证实，且N-DAMO（亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化）过程可由M.oxyfera菌独立完成。

2011年，Hu等人^[25]分别用硝酸盐和亚硝酸盐作为基质培养DAMO微生物，在实验过程中发现，以硝酸盐为基质的培养器中，DAMO细菌与DAMO古菌共同存在；而以亚硝酸盐为基质的培养器中存在着大量的DAMO细菌，DAMO古菌则含量稀少甚至消失。这一实验现象充分说明了DAMO细菌与DAMO古菌对于硝酸盐、亚硝酸盐的选择性，DAMO细菌非常依赖亚硝酸盐的环境，而DAMO古菌则更偏好硝酸盐环境，由此构建了DAMO细菌与DAMO古菌的互营模型：DAMO古菌以甲烷为电子供体，完成将硝酸盐还原为亚硝酸盐的生物反应，DAMO细菌则完成亚硝酸盐转化为氮气的余下步骤。

1.1.3.3 DAMO过程的应用前景与难点

中国每年所需处理的污水数量高达380亿立方米，全国投用的城镇污水处理厂日平均处理水量1.16亿立方米。现阶段污水处理厂（WWTPs）多采用生物法进行处理，如同化、异化、硝化和反硝化等，这需要大量能源与资金的投入，其中生活污水处理所需消耗的电力占全球电力消耗的3%，净化1立方米生活污水需要0.6—0.8元，处理工业废水所需的费用则更为高昂。

异养反硝化是处理富含硝酸盐/亚硝酸盐废水的常用工艺，然而在这一工艺过程中，必须额外添加一些较为昂贵的碳源，如甲醇、蔗糖等，以满足低C/N废水脱氮的要求，同时会产生一氧化二氮这一中间体，作为温室气体，其温室效应是二氧化碳的300倍，同时也是引起臭氧层空洞的主要物质^[26]。因此污水处理厂运行过程中任何技术的改善都将对环境和经济效益产生巨大的影响。

与传统反硝化工艺相比，DAMO具有显著的优势：第一，甲烷作为DAMO过程唯一的电子供体，不仅价格低廉，运输方便，还能从污水处理厌氧消化池中原位获得；第二，DAMO过程剩余污泥产量少，无一氧化二氮的产生；第三，厌氧的反应条件也节约了原曝气所需消耗的能源。2012年，Kampman等人^[27]成功将DAMO过程与UASB消化体系、亚硝化反应器相结合，在低温条件（10—20℃）下进行废水处理。因此，DAMO过程在污水处理方面具有很大的应用前景。

近些年来，厌氧氨氧菌与DAMO微生物在不同反应器中的联合培养成为了研究热点，这一组合被认为是一种环境友好且高效益的脱氮工艺。Zhu等人^[28]利用仅含甲烷、铵根、亚硝酸盐的培养基，在SBR中成功富集了这两类菌，DAMO古菌负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐，DAMO细菌与厌氧氨氧化菌则分别以甲烷和铵根为电子供体，将亚硝酸盐转化为氮气，在此过程中，厌氧氨氧化菌自身所产生的亚硝酸盐就可被DAMO古菌利用。

然而，DAMO微生物生长十分缓慢，细胞比活性也较低，倍增时间14—25天，富集时间长达9—16个月，且富集到一定程度会停止增长，因此急需找到DAMO微生物快速富集的方法，提高微生物活性，才可使DAMO工艺真正运用于实际污水处理。

1.2研究目的及意义

近年来，富含硝酸盐废水的排放是农业和工业中普遍存在的问题，从低C/N废水中去除低成本的（亚）硝酸盐也成为了许多行业的一大挑战。硝酸盐是植物和微生物的重要营养物质，但也是水体安全的潜在威胁，其造成的水体富营养化和藻华，在过去几十年里对公共健康、渔业和生态系统都产生了严重的影响。此外，硝酸盐和亚硝酸盐作为亚硝胺形成的前体，还会导致人类癌症风险的增加。作为对全球气候变暖贡献率达30%的一种温室气体^[29]，甲烷仍在以每年1%的增长速度排放着[]，因此对甲烷的控制也一直是人们关注的热点。

反硝化厌氧甲烷氧化（DAMO）在厌氧条件下，以甲烷为电子供体，硝酸盐/亚硝酸盐为电子受体，完成反硝化过程。这一过程对甲烷、硝酸盐/亚硝酸盐的控制都有着显著的作用，连接着碳氮两大元素之间的循环，无论是在污水处理应用方面，还是生物地球化学循环上都有着具有重大的意义。

这些年，与学者们在DAMO微生物组成、分布情况、反应机理等方面所作的研究相比，DAMO过程的影响因素及影响机制方面的研究还不够透彻，而这部分的研究将对未来DAMO微生物富集条件的优化产生更有针对性的帮助，尽早将DAMO工艺运用于污水实际处理过程中。

本实验以反应器所富集的DAMO菌群为接种泥，在不同环境条件下进行批次实验。实验采用125ml血清瓶，提前在杯壁外侧画取65ml的刻度线，并清洗烘干，待用。常规培养基中含有(每升)：0.5g KHCO₃、0.05g KH₂PO₄、0.3g CaCl₂·2H₂O、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.5ml酸性微量元素溶液和0.2ml碱性微量元素溶液。

（1）温度对DAMO过程的影响

本部分实验共设置三组不同温度：25、30、35℃，每组设三个平行样，共计9个血清瓶。向每个小瓶中倒入50ml常规培养基，再分别取编号为12-1、12-4、12-5、17-3、17-4、17-5的6组DAMO活性较强的太湖底泥，加入每个小瓶至65ml刻度线，最后加入10ml 4号反应器中的生物质，5ml预实验中活性较好的小瓶生物质，用氮气冲洗10min，加塞密封，用注射器向每个小瓶中注入5ml¹³C同位素甲烷，完成预处理。将小瓶放置在不同温度的气浴振荡器（160 r/min）下培养30min后，分别用气相色谱仪（Agilent 7693）、紫外分光光度计（Thermo）对顶空中同位素甲烷和液相中的硝酸盐、亚硝酸盐含量进行初值测定，第二天起每隔6h测样一次，共培养5天。最终进行实验数据的分析与探讨，得出DAMO过程最适温度。

（2）微量元素对DAMO过程的影响

本部分实验选择铁与镍两种微量元素。共设置一组对照、三组铁元素和三组镍元素组，其中对照组中Fe² 浓度为4μmol L^-1；铁组中Fe² 浓度分别设定为12、20、30 μmol L^-1；镍组中Ni 浓度分别设定为0.6、1、2 μmol L^-1，每组设三个平行样，重复（1）中预处理操作，然后将小瓶放置在（1）实验所得到的最适温度下培养，后续测定同（1）实验操作。

（3）甲烷分压对DAMO过程的影响

本部分实验共设置三组不同甲烷分压，每组设三个平行样，预处理及测定过程同（1）实验操作。

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