复合诱变筛选蜡样芽孢杆菌Lys-菌株的研究开题报告

1. 研究目的与意义

蛋氨酸（methionine)，又名甲硫氨酸（α- 氨基-γ-甲硫基丁酸）。甲硫氨酸是一种化学物质，是人体众多的必需氨基酸之一，分子式是c₅h₁₁o₂ns，能参与蛋白质合成。因其无法在体内自身生成，所以必须由外部获得。甲硫氨酸，包括l-甲硫氨酸和d-甲硫氨酸两种构型，l-甲硫氨酸（天然蛋氨酸）是人和动物必需的含硫氨基酸，在生物体内具有重要的生理生化功能，主要参与 dna、蛋白质的合成和蛋白结构的稳定; 是精胺、亚精胺和乙烯等的前体，参与细胞分裂分化、凋亡、稳态和基因表达等生物生长发育的各个方面; 并通过其主要代谢产物 s-腺苷甲硫氨酸( s- adenosylmethionine，sam) 间接调节各种代谢过程，为脂类、蛋白质、核酸、生物碱类和植物固醇等多种化合物提供甲基。

蛋氨酸作为饲料有较多的生物学功能：①作为营养：蛋氨酸在动物体内合成机体蛋白并很快转化为胱氨酸；为机体提供活性甲基，以此合成胆碱、角质素等化合物；提供活性羟基基团，补充维生素b₁₂的部分作用；促进细胞增殖、动物生长。②提高机体免疫力：蛋氨酸是禽畜合成动物蛋白必需的最重要的氨基酸之一。研究表明，当动物被饲喂缺乏蛋氨酸的食粮时，该动物的抗体应答反应会下降。③蛋氨酸能够抑制各种霉菌毒素（如黄曲霉素）的能力，使其毒性大幅度下降，对家禽有防病保健的的作用。如果缺少甲硫氨酸就会导致体内蛋白质合成受阻，造成机体损害。体内氧自由基造成的膜脂质过度氧化是导致机体多种损害的原因。脂质过氧化物会损害初级和次级溶酶体膜，使溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来，对细胞和线粒体膜等重要的细胞器造成损害，甲硫氨酸通过多种途径抗击这些损害。当禽畜缺乏甲硫氨酸时就会产生发育不良、体重减轻、肝肾功遭到破坏、肌肉萎缩等症状。

此外，蛋氨酸在医药领域中可以运用于慢性肝炎、肝硬变、脂肪肝等疾病的预防和治疗，也可以在磺胺、砷类药物中毒中辅助治疗，更是氨基酸输液的重要成分之一。蛋氨酸还可以在医学美容中作为保健护肤品的成分，促进皮肤胶原蛋白的合成和生长激素的分泌，从而达到提高人体免疫功能和有助于健康肌肤的形成的目的。

2. 研究内容和预期目标

蛋氨酸是生命体不可缺少的唯一含硫必需氨基酸， 是多种重要代谢物质的合成前体，对生物体新陈代谢起重要作用。包括参与dna、蛋白质的合成和蛋白结构的稳定; 参与细胞分裂分化、凋亡、稳态和基因表达等生物生长发育的各个方面; 并通过其主要代谢产物s-腺苷甲硫氨酸( s- adenosylmethionine，sam) 间接调节各种代谢过程，为脂类、蛋白质、核酸、生物碱类和植物固醇等多种化合物提供甲基。然而动物体内无法自行合成蛋氨酸，所以必须从外部食物中获取，现有国内外制备蛋氨酸的方法主要是化学法，但是化学法污染大、成本高。而发酵法制备蛋氨酸相对安全，但产量极低。如何获得获得蛋氨酸高产菌株是本课题研究主要内容，主要从菌株诱变条件优化、菌株筛选方法、蛋氨酸测定方法、培养条件优化方法等方面分析。

实验内容：

① 完成一篇外文文献的翻译（5000字以上）；查阅多篇参考文献，至少10篇，外文文献至少2篇；

3. 研究的方法与步骤

1) 蛋氨酸概述从蛋氨酸的结构、功能和产量等方面对蛋氨酸的基本情况进行描述。比较化学法与发酵法生产蛋氨酸的优缺点，并对发酵法生产蛋氨酸的现状进行分析。

2)对已选菌株采用复合诱变介绍蜡样芽孢杆菌的特点和培育高产蛋氨酸菌株的代谢机制和原理，然后介绍复合诱变的方法原理以及相应操作流程和注意事项，接着介绍亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线等几种诱变剂的性能及其在本实验中发挥的作用。从筛选lys-营养缺陷型菌株得到高产蛋氨酸菌株的机制介绍蛋氨酸的生产现状。

3) 检查诱变结果及菌种培养条件优化检查复合诱变的结果，筛选出并富集培养诱变成功的赖氨酸缺陷型菌株。同时，不断优化培养基成分、优化培养条件以及尝试在培养基中加入前体的方法，多次进行发酵培养，通过相关的实验数据研究最优化培养条件。

4. 参考文献

[1] niu k, xu y y, wu w j, et al..effect of dissolved oxygen on l -methionine production from glycerol by escherichia coli w3110bl using metabolic flux analysis method[j]. journal of industrial microbiology biotechnology, 2020, 47(3):287-297.

[2] chen h l , zhu n q, wang y , et al.. increasing glycolysis by deletion of kcs1 and arg82 improved s-adenosyl-l-methionine production in saccharomyces cerevisiae[j]. amb express, 2021, 11(1):1-16.

[3] tang x l , du x y , chen l j , et al.. enhanced production of l-methionine in engineered escherichia coli with efficient supply of one carbon unit[j]. biotechnology letters, 2019, 42(1):429-436.

5. 计划与进度安排

1)2022-2022-1学期第17-19周-2022-2022-2学期第4周（2022.12.28-2022.03.28） 完成翻译，菌株活化，建立诱变流程，开题报告编写；

2)第5-7周（2022.03.29-2022.04.18）诱变预实验，正式试验，采用亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线等复合诱变；

3)第8-9周（2022.04.19-2022.05.02）筛选获得lys缺陷型；做3轮以上实验，验证是否是lys缺陷型